传染性支气管炎病毒活疫苗对H9N2亚型禽流感病毒致病力影响实验

赵国生王 友尤永君韩明宝孙宏飞曹国霞

(1.青岛正大有限公司,山东青岛 266000; 2.天津瑞普生物技术股份有限公司,天津 300000; 3.河北省宁晋县畜牧局,河北宁晋 055550)

传染性支气管炎病毒活疫苗对H9N2亚型禽流感病毒致病力影响实验

赵国生1王 友2尤永君2韩明宝2孙宏飞3曹国霞3

(1.青岛正大有限公司,山东青岛 266000; 2.天津瑞普生物技术股份有限公司,天津 300000; 3.河北省宁晋县畜牧局,河北宁晋 055550)

自1997年以来，由H9N2禽流感病毒感染造成的家禽业的重大损失已被大量报道。某肉鸡养殖场由H9N2造成的死亡率高达65%，然而实验室鉴定分离出的H9N2病毒是低致病性病毒。低致病性流感病毒与其他呼吸道病原体的混合感染，被发现会导致非常高的死亡率。近年来流行的造成商品肉鸡高死淘率的支气管堵塞，经实验证实与传染性支气管炎病毒和H9共感染有很大关系。传染性支气管炎活疫苗被广泛用于商品肉鸡，用来防控鸡传染性支气管炎。为了探究传染性支气管炎活疫苗是否影响低致病性禽流感病毒的致病性，本研究中就传染性支气管炎活苗免疫对H9N2亚型禽流感病毒的致病力在SPF鸡和SPF鸡胚上的影响进行了一系列实验。

1 材料

1.1 生物材料

试验研究

1.2 仪器设备及试剂

负压隔离器，鸡胚孵化器，振荡器，96孔V型反应板，SPF鸡，饲料和饮水，其他化学试剂皆是国产分析纯产品。

2 方法

2.1 SPF鸡实验分组

120只20日龄SPF鸡，平均分成3组。第1组每只鸡喷雾接种1羽份的IBV活疫苗，第2组每只鸡滴鼻接种106.0EID50H9N2病毒，第3组每只鸡接种1羽份IBV活疫苗+106.0EID50H9N2病毒。分组及接种情况见表1。

2.2 排毒时间检测

每天收集所有组鸡只的肛门拭子，利用禽流感病毒抗原检测试剂盒进行RT-PCR检测。试剂盒检测阳性样品经无菌处理后尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，鸡胚在37℃和相对湿度为55%的孵化器内孵化48h，然后，收集尿囊液标本，进行血凝（HA）和与鸡抗血清进行血凝抑制（HI）检测禽流感病毒H9N2病毒的存在。

Cite this article as: BI Jian-Ping, LI PING, XU Xi-Xi, WANG Ting, LI Fei. Anti-rheumatoid arthritic effect of volatile components in notopterygium incisum in rats via anti-inflammatory and anti-angiogenic activities [J]. Chin J Nat Med, 2018, 16(12): 926-935.

2.3 SPF鸡胚实验分组

40只10日龄鸡胚患者随机分为四组，接种0.2毫升的H9N2亚型禽流感病毒（106EID50 /胚）和/或IBLV（一个剂量的疫苗）。对照组的鸡胚接种无菌PBS。鸡胚在37℃和相对湿度为55%的孵化器内孵化48h，观察鸡胚的肉眼病变。鸡胚接种分组情况如下表2。

3 结果

3.1 SPF鸡临床症状观察

接种病毒前，对所有群体的日常监测结果表明，所有的鸡临床表现正常，没有发现任何的异常。H9 +IBV活疫苗组：接种两天后，鸡群开始出现精神沉郁，羽毛逆立，呼吸困难，眼眶周组织和鼻窦肿胀，结膜炎，鼻、眼有分泌物，一直持续到接种后六天。个别鸡只，出现严重的呼吸困难，伸颈张嘴呼吸。分析认为极度呼吸困难是造成高死亡率的主要原因。

（1）H9接种组：接种H9亚型禽流感病毒30只鸡，其中有2只鸡显示轻微的临床症状，如精神沉郁，鼻和眼有少量分泌物和轻微结膜炎。

（2）接种IBV活疫苗组未发现临床症状；阴性对照组未出现临床症状。

（3）混合接种H9亚型禽流感病毒和IBV活疫苗的鸡群有10%（3 / 30）的死亡率，死亡开始于接种后48h；而单独接种H9病毒或IBV活疫苗组和阴性对照组未见死亡鸡只出现。

3.2 剖检病变观察

对所有死亡鸡只进行剖检后，发现气管和肺脏充血、出血，在支气管深部发现黄色堵塞物，黄色堵塞物一直延伸到上支气管（图1）

表1 SPF鸡接种实验分组

表2 SPF鸡胚接种实验分组

表3 H9排毒持续时间检测结果

图1 H9+IBV活疫苗组死亡鸡中形成气管分叉管型（箭）延伸到支气管（A）；经过甲醛固定的气管末端出现黄色堵塞物（B）。

3.3 H9排毒持续时间

混合接种H9和IBV活疫苗的鸡群从接种后2天到11天，都能从肛门拭子中检测到H9亚型禽流感病毒阳性；单独接种禽流感病毒的鸡群从接种后3天到9天，从肛门拭子中检测到H9亚型禽流感病毒阳性；单独接种IBV活疫苗组和空白对照组没有检测到H9阳性情况。各实验组H9排毒检测情况见表3。

3.4 SPF鸡胚病变观察

接种H9和IBV活疫苗组SPF鸡胚发育明显迟缓，鸡胚皮下充血、有点状出血；其他三组鸡胚发育和剖检皆无异常。各组鸡胚病变情况见图3。

图3 各组鸡胚病变情况观察，接种H9+IBV活疫苗组鸡胚（b1-b4）比接种H9鸡胚组（a）明显发育迟缓（A）；接种H9 + IBV活疫苗组鸡胚表面充血，皮下组织有多量出血点，而单独接种H9或者IBV活疫苗组没有显示出任何病变（B）。

4 讨论

在我国H9N2亚型禽流感仍是当前禽流感流行的主要亚型。1995年唐秀英等从四川省某发病鸡群中分离到一株H9N2毒株，从西昌发病鸡群中分离到了2株H9N2毒株。此后又从我国部分地区的发病鸡群、鸭群和猪群中，分离到16株H9N2病毒。由于H9N2禽流感病毒属于低致病力病原，单纯感染不能引起家禽发病，在动物疫病防控中往往被忽略，从而使其得以广泛传播和长足进化，目前在全球范围内的野鸟和家禽中广泛分布。

然而近年来H9N2禽流感的爆发频繁导致肉鸡养殖场的高死亡率，造成巨大的经济损失。但从发病鸡群中分离出致病病毒，实验室检测仍然表现为低致病性。到目前为止，对于在野外和实验室发生的由H9引起严重临床症状和高死亡率还没有明确解释。我们猜测可能与H9和其他呼吸道病原体混合感染有很大关系。

本研究的结果表明，H9+IBV活疫苗混合接种比单纯接种H9会造成更严重的临床症状和剖检变化；混合接种甚至能够引起感染鸡的死亡。商品鸡场死亡报告中，提到的一系列死后损伤如气管阻塞、肺充血、气管分叉处形成的气管栓塞，在本实验病鸡剖检中均被观察到。气管深部形成的黄色堵塞物，可能是造成窒息死亡的主要原因。众所周知，类胰蛋白酶对HA裂解活化是必要的，在病毒的致病性中发挥关键作用。在本实验中，IBV活疫苗可能提供相关的酶，一定程度上增强了H9的致病性。据报道，一种丝氨酸蛋白酶结构域是由冠状病毒IBV编码的，在此情况下类似酶的存在可能增加H9N2亚型禽流感病毒的致病性。普遍认为，禽流感临床症状和致死效应在细菌病原体、环境条件和其他应激存在的条件下，会造成更大的损失，本次实验也证实了此种观点。

H9+IBV活疫苗混合接种SPF鸡胚与单纯接种H9鸡胚相比，在H9排毒时间上有所提前，并且排毒持续时间也有所延长。这可能是造成两组鸡胚不同病变程度的原因。混合接种组鸡胚发育明显小于单独接种H9组；混合接种组鸡胚病变程度明显严重于单独接种H9组。这些病变差异与SPF鸡实验组结果呈现出了一致性。

总之，本次实验结果显示，在实验室条件下ILV活疫苗与H9的混合感染促进了H9的传播、增强其致病性、延长了病毒的排毒期限，同时引起了较高的死亡率。关于IBV临床分离毒株对H9N2禽流感病毒致病性的影响以及环境因素的影响，还需要进一步的实验研究去证实。

[1] 李树纯，李心海，仲书官，等. H9N2亚型禽流感病毒基因组的遗传进化分析[J].病毒学报，2012（01）：13

[2] 陈陆，刘守川，赵军，等.不同H9N2亚型禽流感病毒分离株致病力研究及HA抗原性变异分析[J].中国农业科学，2011，（24）：19.