纯红细胞再生障碍性贫血临床特点与RPS19、RPL5、RPL11基因突变之多中心研究

廖雪莲， 蒋莎义， 蒋 慧， 何海龙， 陈力军， 谢晓恬

(1. 上海交通大学附属儿童医院血液/肿瘤科，上海 200062; 2. 苏州儿童医院血液科，江苏 苏州 215001;3. 山东省儿童医院血液科，山东 济南 250021; 4. 同济大学附属同济医院儿科，上海 200065)



·基础研究·

纯红细胞再生障碍性贫血临床特点与RPS19、RPL5、RPL11基因突变之多中心研究

廖雪莲1， 蒋莎义1， 蒋 慧1， 何海龙2， 陈力军3， 谢晓恬4

(1. 上海交通大学附属儿童医院血液/肿瘤科，上海 200062; 2. 苏州儿童医院血液科，江苏 苏州 215001;3. 山东省儿童医院血液科，山东 济南 250021; 4. 同济大学附属同济医院儿科，上海 200065)

目的 通过对纯红细胞再生障碍性贫血的临床回顾与RPS19、RPL5、RPL11基因突变的检测，分析比较先天性纯红细胞再生障碍性贫血与获得性纯红细胞再生障碍性贫血的临床异同和RPS19、RPL5和RPL11基因突变情况。方法 20例来自多中心的儿童纯红细胞再生障碍性贫血，先天性14例，获得性6例，分析临床资料并比较两组发病年龄、外周血细胞计数和对治疗的反应。Sanger双脱氧链终止法对患儿RPS19、RPL5和RPL11基因测序。结果 先天性纯红细胞再生障碍性贫血42.8%伴有先天畸形，与获得性纯红细胞再生障碍性贫血比较，网织红细胞较低(P<0.05)，外周血WBC、HGB和PLT无差异。激素治疗有效率分别是： 先天性78.6%、获得性100%(P<0.05)。先天性纯红再障7.1%检出RPS19点突变，获得性纯红再障未发现RPS19突变。先天性纯红再障和获得性纯红再障RPL5和RPL11基因均未发现突变。结论 先天性纯红再障42.8%合并畸形，网织红细胞均低于获得性纯红再障，RPS19突变率低于国外文献报道。RPS19突变可能与先天性纯红再障有关。获得性纯红再障发病与RPS19、RPL5和RPL11基因异常可能无关。

纯红细胞再生障碍性贫血； 核糖体蛋白基因； 基因突变

纯红细胞再生障碍性贫血(pure red cell aplasia PRCA)，简称纯红再障。是一类骨髓红系增生不良性疾病，临床以贫血、外周血红细胞、血红蛋白和网织红细胞减低，骨髓象幼红细胞明显减少或缺如为特征。分为先天性纯红再障(Diamond-BIackfan综合征，DBA)和后天获得性纯红再障，后者又有原发性和继发性之分。后天获得性纯红再障为急性自限性疾病，主要见于儿童。先天性和后天性纯红再障的鉴别诊断主要取决于发病年龄和先天性畸形。十年前，发现在部分DBA中存在核糖体蛋白S19(RPS19)基因突变[1]，而相同的突变形式在获得性纯红再障未见报道。近年来，国际上还发现部分DBA患者除RPS19外，还伴有RPS24、RPS17、RPL5、RPL11等这些核糖体蛋白异常，提示DBA的本质可能为核糖体疾病。纯红再障治疗首选糖皮质激素，获得性少有复发；环孢素A(CSA)也是治疗纯红再障的主要药物之一。本研究对4家医院近3年接诊的20例纯红细胞再生障碍性贫血患儿行核糖体蛋RPS19、RPL5和RPL11基因测序并做临床分析。

1 资料与方法

1.1 临床资料

来自上海市儿童医院、苏州儿童医院、山东省立医院、同济大学附属同济医院儿科的纯红细胞再生障碍性贫血20例，年龄1个月至5岁。所有患儿在采集临床资料、血液和骨髓标本前均获取了其监护人的同意。其中先天性纯红再障14例，男8例，女6例，发病年龄出生到1岁，中位年龄5月。获得性纯红再障6例，男女各3例，发病年龄24～60个月。随访6～36个月。

1.2 诊断、分型和疗效标准

纯红细胞再生障碍性贫血诊断标准[1]： 正细胞正色素性贫血，白细胞、血小板数正常或稍增加；网织红细胞降低；骨髓红系各阶段显著低于正常，粒系、巨核系各阶段在正常范围内。先天性1岁半以内发病，常伴有畸形；继发性多继发于感染、药物等。原发性实验室可发现淋巴细胞比例和免疫球蛋白异常，贫血对免疫抑制剂治疗有反应。

疗效标准参照成人： 基本治愈、缓解和明显进步均为有效[1]，即至少达到无症状，无输血依赖，血红蛋白较治疗前上升大于30g/L，维持3个月不降；无效为血红蛋白不增或增加不到30g/L。

1.3 RPS19、RPL5及RPL11基因测序

抽取患儿外周血2ml，EDTA防凝，提取DNA(血液基因组DNA提取试剂盒)，DNA终浓度为50～100ng/μl，OD260/OD280比值介于1.7～1.9，PCR仪(GeneAmp PCR System 9700)分别扩增RPS19、RPL5及RPL11基因片段： 上、下游引物，2×PCR MasterMix，终反应体积25μl。Sanger法-双脱氧链终止法测序： PCR产物纯化后，测序引物3.2pmol/μl 1μl，BigDye 8μl，模板DNA 1μl，Rnase Free dH2O μl，终反应体积20，测序PCR循环： 95℃ 5min→(95℃ 30sec →52℃ 10sec→60℃ 4min)×50个循环→4℃保温。测序产物纯化，上样，基因测序仪HITACHI3500xL Genetic Analyzer(applied biosystem inc， USA)测序反应。

1.4 统计分析

用SPSS 17.0软件统计方差及均值，均数用t检验，率用方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 临床特征

20例患儿均以贫血就诊，其中先天性纯红再障(DBA)14例。6例DBA伴有畸形，5例DBA伴有畸形，包括六指、室缺、多囊肾和身材矮小，1例有白内障和智力发育落后。其中有1例DBA患儿有家族贫血史，该患儿姐姐4个月时因贫血性疾病死亡，另1姐姐健在，无贫血。而6例获得性纯红再障未发现伴有畸形，并否认家族贫血史。

2.2 实验室检查

20例纯红再障均为正细胞性贫血，发病时血红蛋白28～70g/L，网织红细胞比例0.1%～0.5%。外周血象示白细胞、血小板计数均在正常范围。骨髓象示： 红系增生低下，粒系、巨核系无异常。其中17例查coombs试验，未发现阳性。9例查EB病毒抗体，其中包括6例获得性纯红再障，均阴性。5例查微小病毒B19抗体(包括4例获得性纯红再障)，均阴性。DBA发病年龄早，与获得性纯红再障比较，网织红细胞更低，而发病时血红蛋白水平、白细胞和血小板计数等均无差异，见表1。

表1 DBA与获得性纯红再障临床异同

注： DBA，先天性纯红再障；HB，血红蛋白；WBC，白细胞；PLT，血小板；RET，网织红细胞。P<0.05表示有统计学意义

2.3 治疗

所有患儿初治时均每日口服糖皮质激素泼尼松1.5～2mg·kg-1，血红蛋白达100g/L以上后逐渐减量，小剂量维持直至停药；4～6周无效，则停用。6例获得性纯红再障，激素治疗有效，完全恢复正常6/6(100%)，2～6个月停药。14例DBA，皮质激素11例有效11/14(78.6%)，3例完全停药3/14(21.4%)，8例小剂量维持8/14(57.1%)，其中包括2例停药后反复，再次应用皮质激素的患儿。获得性激素治疗的有效率高于DBA，但确切概率法，无差异(78.6%，100%)，P=0.13，可能受样本量小影响。5例激素无效者，1例有贫血家族史，新生儿期既发病，输血依赖；另4例加用环保霉素A(CSA)，每日3～5mg/kg，3例有效，仍在治疗中，1例无效，输血依赖。

2.4 RPS19、RPL5及RPL11基因基因测序结果

14例先天性纯红再障(DBA)患儿，检测到1例基因突变，显示为Exon4点突变： c.185G>A(p.R62Q)，其父母随后亦行RPS19基因测序，不存在RPS19基因突变；6例获得性纯红再障未发现RPS19基因突变。14例DBA和6例获得性RPL5和RPL11基因均未发现突变。

3 讨 论

根据正细胞性贫血，网织红细胞减低和骨髓单纯红系增生不良，纯红再障诊断并不困难。但纯红再障在儿童需鉴别先天性和获得性。前者发病年龄早并伴有多种畸形；后者可找到潜在病因和部分患儿呈自限性。

先天性纯红再障(DBA)在儿童多见，获得性相对少，本组资料先天性与获得性为7∶3。DBA大部分病例呈散发，家族病例表现为不全显性的常染色体显性遗传。发病率为每百万活产新生儿中4～7例，大多在生后3个月内诊断，99%于5岁前诊断。本组大多患儿于1岁内确诊，其中一例出生即发病男性患儿有贫血家族史。14例DBA中6例合并畸形，与文献40%的畸形发生率相近。本组研究收集的DBA与获得性纯红再障病例之间血红蛋白、白细胞和血小板水平均无差异，唯先天性患儿网织红细胞较低。

获得性纯红再障又分原发性和继发性，前者找不到病因，可能与多种异常的免疫反应有关；后者常继发于胸腺瘤、白血病和淋巴瘤、某些病毒感染[2]、药物[3]、自身免疫性疾病或移植后[4]等。与成人多表现为慢性过程不同，儿童获得性纯红再障临床常表现为急性自限性，病因以病毒等感染为主。本组资料未发现EBV和微小病毒B19感染证据，可能与病例数少和有的患儿检测时间较晚有关。

纯红再障治疗首选糖皮质激素，14例DBA强的松口服有效率为78%，与文献报道相似[5]。获得性纯红再障6例强的松口服有效率100%，高于文献的60%。一方面由于病例数少；另一方面，本资料仅为儿童，而文献数据则是成人病例占多数；再则，因无治疗前的观察随访期，可能包含了自愈患儿。因10%～15%的获得性纯红再障患者呈现一个自限性过程，在制定治疗方案前可观察随访1个月。CSA用于皮质激素治疗失败的患儿，大部分患儿获缓解。近来研究将CSA作为一线用药，认为CSA治疗可以维持比糖皮质激素更长的初始缓解持续时间[6]。

RPS19是最早发现的与DBA相关的基因突变，大约25%的DBA患者中存在RPS19突变[7-9]。随后又有包括RPS24、RPS17、RPS10、RPS26、RPL5、RPL11和RPL35a在1%～10%的DBA中被发现突变[10-12]。RPS19基因编码蛋白为构成核糖体40S小亚基蛋白之一，其缺陷被认为导致DBA[13]。在人红系白血病细胞TF1或CD34+祖细胞中siRNA敲除RPS19后导致增生减低。RPS19缺陷，斑马鱼生长迟缓、红细胞分化缺陷和呈细胞凋亡增加的低增生性贫血[14]。国内报道21例DBA，检测到3例RPS19基因突变[15]。本组研究14例DBA中发现1例RPS19基因突变，为外显子4的点突变；其为3岁女患儿，在3个月时诊断，长期小剂量糖皮质激素维持血红蛋白100g/L左右，身材发育落后。但本组1例DBA患儿有类似疾病家族史和1例合并多种畸形并伴有智力落后的患儿，被认为很有可能存在基因突变却未检出RPS19基因异常。家族性发生的DBA病例显示常染色体显性遗传方式，检测到的RPS19基因突变患儿的双亲未发现同样异常。核糖体蛋白，尤其RPS19的基因突变与DBA的发病有密切关系，但50%的患者无核糖体基因异常，同时我们对纯红20例纯红再障进行了RPL5、RPL11基因测序检测，然而均未发现突变。根据检测结果，推测RPS19突变可能与先天性纯红再障有关；获得性纯红再障发病与RPS19、RPL5和RPL11基因异常可能无关。目前关于DBA的病因和发病机制仍不十分清楚，除核糖体蛋白基因外，还有哪些基因异常是DBA的病因，该病的遗传方式如何都是有待探讨的问题。获得性纯红再障是否在某些基因异常基础上发病，也有待进一步探讨。

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Clinical characteristics and RPS19, RPL5, RPL11 gene mutation of pure red cell aplasia

LIAOXue-lian1，JIANGSha-yi1，JIANGHui1，HEHai-long2，CHENLi-jun3，XIEXiao-tian4

(1. Dept. of Hematology/Oncology， Shanghai Children’s Hospital， Shanghai Jiaotong University， Shanghai 200062， China; 2. Dept. of Hematology， Suzhou Children’s Hospital; Suzhou 215001， Jiangsu Province， China;3. Dept. of Hematology， Shandong Children’s Hospital; Jinan 250021， Shandong Province， China;4. Dept. of Paediatrics， Tongji Hospital， Tongji University， Shanghai 200065， China)

Objective To investigate clinical features and RPS19， RPL5 and RPL11 gene mutations in patients with acquired pure red cell aplasia(PRCA) and congenital PRCA(Diamond-Blackfan anemia， DBA). Methods Twenty children with PRCA from multiple centers were enrolled， including 14 DBA and 6 acquired PRCA. The age of disease onset， peripheral blood counts， and responses to treatment were compared between these two groups. RPS19， RPL5 and RPL11 gene sequences were determined using the Sanger dideoxy chain termination method. Results Six out of 14 DBA patients(42.8%) presented combined congenital malformation. Compared with the acquired PRCA patients， DBA patients displayed a lower number of reticulocytes(P<0.05)， no differences in peripheral white blood cell(WBC)， hemoglobin(HB)， and platelet(PLT) counts. The efficacy of corticosteroids treatment for DBA was 78.6%， while that for acquired PRCA was 100.0% (P>0.05). RPS19 point mutations were detected in 1 DBA patient， and not in acquired PRCA patients. RPL5 and RPL11 point mutations were not detected in DBA or acquired PRCA. Conclusion Patients with DBA have lower reticulocyte counts than acquired PRCA patients. DBA might be associated with RPS19 gene mutation.

Diamond-Blackfan Anemia(DBA)； Pure Red Cell Aplasia(PRCA)； Gene Mutation； RPS19； RPL5； RPL11

10.16118/j.1008-0392.2015.06.007

2015-08-24

上海交通大学自然科学基金(13XJ10069)

廖雪莲(1978—)，女，主治医师，硕士.E-mail： liaoxl@shchilren.com.cn

蒋莎义.E-mail： jiangsy@shchildren.com.cn

R 725.5

A

1008-0392(2015)06-0036-04