木犀草素直肠保留灌肠对哮喘模型大鼠幼鼠干扰素-γ及白细胞介素-4的影响

洪丽军，魏广州，陈祖仁，刘克新*，张永政，王芳，王丛礼

（牡丹江市中医医院儿科，黑龙江牡丹江157000）

木犀草素直肠保留灌肠对哮喘模型大鼠幼鼠干扰素-γ及白细胞介素-4的影响

洪丽军，魏广州，陈祖仁，刘克新*，张永政，王芳，王丛礼

（牡丹江市中医医院儿科，黑龙江牡丹江157000）

目的：探讨木犀草素直肠保留灌肠对哮喘模型大鼠幼鼠血清中干扰素-γ（IFN-γ）及白细胞介素4（IL-4）的影响。方法将80只雌雄各半SD大鼠幼鼠分成空白组、模型组、灌胃组、灌肠组，各20只。运用ELISA法测定血清中IFN-γ及IL-4含量，镜下观察哮喘模型大鼠幼鼠肺组织变化。结果与模型组比较，灌肠组和灌胃组均可明显升高支气管哮喘大鼠血清IFN-γ含量，及降低IL-4含量，差异具有统计学意义（P＜0.01）。灌肠组与灌胃组病理组织学观察肺组织浸润减少，管壁和平滑肌厚度减少，组织充血水肿现象减轻。结论木犀草素保留灌肠能够降低哮喘大鼠幼鼠血清中IL-4及增加IFN-γ含量。

木犀草素；哮喘；白细胞介素4；干扰素-γ；保留灌肠；大鼠幼鼠

哮喘已经成为仅次于癌症的世界第二大致死和致残疾病，而中国已经成为全球哮喘病死率最高的国家之一［1］。哮喘病因迄今尚未完全明确。其病因多样，研究发现有多种基因参与，同时其发病也离不开

个体因素和环境因素的共同作用［2］。研究表明Th1／Th2失衡理论是哮喘发病机制的重要原因之一［3-4］。哮喘发作期患儿血清中代表Th1功能的IFN-γ水平降低，代表Th2功能的IL-4水平明显升高［5］。中药在治疗哮喘方面优势明显，其中木犀草素（luteolin）作为中药复方中的一个单体已被证实有明确的抗炎作用。木犀草素是一种天然黄酮类化合物，广泛存在于络石藤、羊乳、透骨草、金银花等植物中［6-7］。有研究发现其具有抑制哮喘小鼠气道重建的作用［8］。本实验拟建立大鼠幼鼠哮喘模型，应用木犀草素通过保留灌肠途径对哮喘模型大鼠幼鼠进行干预，观察其血清中IFN-γ及IL-4的变化。以探讨木犀草素治疗哮喘的机制。

1 实验材料

1.1 实验动物SPF级SD雄性大鼠幼鼠80只，雌雄各半，4周龄，体质量（80±15）g。由青岛派特福德白鼠养殖专业合作社提供。动物毛色均匀，反应良好，性情温和，无脱毛、断尾现象。

1.2 药物与试剂实验所需木犀草素（纯度＞98%）购于陕西华腾科技有限公司，氢氧化铝干粉Aluminum hydroxide（分析纯）：天津市巴斯夫化工有限公司生产，批号：20120926。卵清蛋白Albumin Egg（GradeⅡCrude dried egg white），Ovalbumin.MW：44287 Da by calculation；大鼠血清IL-4、大鼠血清IFN-γ酶联免疫试剂盒（酶联免疫分析法）购于哈尔滨市顺成医科经销部。

1.3 主要仪器402AI型超声雾化器，江苏鱼跃医疗设备有限公司；JY5002型电子天平（0.01～500 g），上海精密科学仪器有限公司；BS223S型电子天平（0.001～220 g），北京赛多利斯仪器系统公司；KD-TS3D1型组织自动脱水机，浙江金华市科迪仪器设备有限公司；全自动酶标仪，美国；微量移液器，德国艾本德公司；Anke TGL-16G型台式离心机，上海安亭科学仪器厂。

2 实验方法

2.1 幼鼠哮喘模型的制备参考相关文献，将大鼠适应性饲养3 d后，除去空白对照组幼鼠，剩余各组幼鼠在第1、7天致敏，即腹腔注射卵清蛋白和氢氧化铝混合液共1 mL（含100 mg氢氧化铝和1 mg卵清蛋白）。在第15、16、17、18、19天，分别给予雾化吸入3%鸡卵白蛋白（OVA）20 min，空白对照组以生理盐水代替卵清蛋白进行腹腔注射及雾化吸入。观察幼鼠出现呼吸加快、焦躁不安、点头呼吸及站立不稳等反应，作为判定模型动物症状阳性的指征。

2.2 实验动物分组与给药在适应性饲养之后，将80只大鼠随机分为4组，即空白对照组、哮喘模型组、木犀草素灌胃组（以下称灌胃组）、木犀草素灌肠组（以下称灌肠组），每组20只。对每只大鼠分别标记号码，组间平均体质量差控制在20 g以内，进行药物干预实验。

治疗组均从第1次哮喘激发开始（造模第15天）至处死前每天灌胃或灌肠给药。灌肠组幼鼠每只每天给予木犀草素30 mg／kg灌肠1次；灌胃组幼鼠每只每天给予木犀草素30 mg／kg灌胃1次。以上各组连续给药7 d，每组随机处死10只，进行实验研究；各组剩余10只，继续给药7天后处死进行实验研究。空白对照组不做任何干预。

灌肠具体方法：轻柔按摩幼鼠肛门促使其尽量排空结肠下段大便后，一人戴厚手套左手将幼鼠翻转固定使腹部朝上，右手轻轻向下拉幼鼠尾巴，露出肛门。另一人用1根无菌20号大鼠灌胃针接上5 mL无菌注射器，石蜡润滑后缓慢插入，深度约4～6 cm，慢慢推入灌肠药物，一般在给药时需要用手按压肛门以防药液滴出，必要时可用棉花包埋好的塑料小夹轻轻夹住肛门，保持肛门高位6 min，尽量避免药物流出。

2.3 实验标本采集于实验的第21天和最后1天，各组实验动物随机抽选10只称重，并进行大鼠眼眶取血，收集静脉血；用于测定血清IFN-γ及IL-4，并开胸取出肺脏用于观察组织病变情况。

2.4 检测项目及方法

2.4.1 一般观察观察各组幼鼠的体质量、粪便、毛发情况、饮食情况、活动度、精神状态等，并做相关记录。

2.4.2 血清IFN-γ及IL-4的测定给药结束后，将各组幼鼠腹腔注射10%水合氯醛（350 mg／kg）麻醉，进行眼眶取血，静置15 min，然后4℃，3 000 r／min，离心10 min，取上层血清，-20℃冰箱冻存待检。以ELISA方法检测各组大鼠血清中IFN-γ及IL-4的表达情况。IFN-γ、IL-4测定严格按ELISA试剂盒说明操作（采用酶联免疫吸附ELISA法）。

2.4.3 幼鼠肺病理组织学观察动物麻醉完全后，开胸和开腹取肺组织和结肠，用4%多聚甲醛固定，脱水、包埋、切片，苏木精-伊红HE染色，镜下观察病理学改变。

2.5 统计分析所有数据均用SPSS 10.0统计分析软件处理。实验数据以均数±标准差（¯x±s）表示，组间采用单因素方差分析的方法进行统计分析。显著性差异水平以P＜0.05或P＜0.01为标准。

3 实验结果

3.1 木犀草素对支气管哮喘大鼠一般状态的影响

模型组及用药组大鼠在吸入OVA后不久即出现躁动不安，搔抓颜面皮毛，呼吸急促，严重者呼吸减慢，节律不齐，时快时慢，喷嚏或咳嗽，口鼻、四肢和尾尖轻度紫绀，竖毛，活动明显减少或俯卧不动。随着激发次数的增多，上述症状出现增多并加重，经连续激发后体质量减轻，毛发少光泽，四肢瘫软，反应迟钝，呼吸及幅度紊乱。继而大鼠俯伏不动，出现呼吸急促，呼吸困难（明显的腹式呼吸），部分大鼠口鼻流出黏液，严重者出现呼吸不规则。反复激发后大鼠毛色失去光泽，精神不振和反应迟钝。而空白组则无此表现。

与哮喘模型组比较，木犀草素灌胃给药组和灌肠给药组症状均减轻，但仍有呼吸急促，呼吸困难的现象。灌胃给药组和灌肠给药组大鼠表现相似，没有发现明显区别。

3.2 血清IFN-γ及IL-4的测定

3.2.1 对支气管哮喘大鼠幼鼠血清IL-4含量的影响

与空白组比较，模型组大鼠幼鼠血清IL-4含量增加，其差异具有统计学意义（P＜0.01）；而木犀草素灌肠组和灌胃组与模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

3.2.2 对支气管哮喘大鼠幼鼠血清IFN-γ含量的影响与空白组比较，模型组大鼠幼鼠血清IFN-γ含量降低，其差异具有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，木犀草素灌肠组和灌胃组均可明显升高支气管哮喘大鼠血清IFN-γ含量，差异具有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠血清IL-4、IFN-γ含量比较（¯x±s，n＝10）

3.3 木犀草素灌肠对大鼠幼鼠支气管-肺组织病理学的影响经染色和镜下病理学观察（图略）：1）空白对照组，可见大鼠肺组织支气管内及周围无明显炎性细胞浸润，管壁完整，管壁和平滑肌厚度正常，细胞排列规整，组织黏膜未见充血水肿，肺泡间隔狭窄，肺泡腔清亮宽敞。2）模型组，可见支气管壁、管腔内及血管、支气管周围有嗜酸性粒细胞及淋巴细胞为主的炎性细胞浸润，黏液腺增生，支气管黏膜水肿、增厚、上皮脱落、微血管渗漏、管腔内分泌物增多，基层细胞增生、平滑肌增厚，组织黏膜充血水肿，肺泡间隔变宽，肺泡腔变狭窄。3）灌肠组与灌胃组，可见肺组织嗜酸性粒细胞及其他炎性细胞浸润减少，管壁和平滑肌厚度减少，黏膜结构较完整，周围组织充血水肿现象减轻，肺泡腔变宽，肺泡间隔变窄。

4 讨论

中药复方在治疗儿童哮喘方面有明显优势，我科在临床中应用中医经典方剂三子养亲汤治疗哮喘取得了良好的疗效。其中紫苏的有效成分即是木犀草素。木犀草素已被证实具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗变应性、抗病毒和细胞保护等作用［9-10］。有研究发现，木犀草素还通过其他机制参与免疫反应和炎症的调节。如抑制NF-κB介导的基因表达［11］。DAS M等［12］研究发现木犀草素能显著减轻哮喘的症状，减轻支气管收缩和气道高反应性，降低血清中特异性IgE的水平，减少支气管肺泡灌洗液中IL-4、IL-5，增加干扰素-γ（IFN-γ）、PDGF-BB的产生。该研究结果表明，木犀草素具有调节哮喘木星Th1／Th2平衡的作用。

研究表明，直肠壁是一种半透膜，其具有选择性吸收和排泄功能。婴幼儿肠壁较薄，具有通透性高、肠壁孔隙大、蛋白质结合率低、可使药物分布容积呈增大趋势的优点［13］。

本实验通过木犀草素保留灌肠给药，观察大鼠幼鼠哮喘模型血清中IFN-γ、IL-4的含量及肺组织炎性改变。结果表明灌肠组较模型组血清中IFN-γ显著增高，IL-4显著降低。揭示了木犀草素治疗哮喘的机制可能为调节Th1／Th2平衡，抑制Th2细胞活化。灌肠组与灌胃组血清中IFN-γ、IL-4含量差异无统计学意义，提示木犀草素灌肠给药与灌胃给药在疗效上相当。灌肠组肺组织嗜酸性粒细胞及其它炎性细胞浸润减少，管壁和平滑肌厚度减少，组织充血水肿现象减轻，肺泡腔变宽，肺泡间隔变窄。说明木犀草素保留灌肠可减轻肺组织炎性浸润。

参考文献：

［1］屈能胜.来势汹汹的哮喘病［J］.医药与保健，2004，12（11）：4-5.

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［3］BARBAS A S，DOWNING T E，BALSARA K R，et al.Chronic aspiration shifts the immune response from Thl to Th2 in a murine lnoltel of asthma［J］.Eur J Clin Invest，2008，38（8）：596-602.

［4］MALERBA G，PIGNATTI P F.A review of asthma genetics：gene expression studies and recent candidates［J］.J Appl Genet，2005，46：93-104.

［5］卢彦，黄兴楚，宋承东.儿童支气管哮喘血清IL4、INF-TGF-8l和IL-l0的变化及临床意义［J］.医学临床研究，2009，26（2）：23l-233.

［6］FORMICA J V，REGELSON W.Review of the biology of quercetin and re-lated bioflavonoids［J］.Food Chem Toxicol，1995，33（12）：1061-1080.

［7］FOTSIS T，PEPPER M S，AKATAS E，et al.Flavonoids，dietaryderived inhi-bitors of cell proliferation and in vitro angiogenesis［J］.Cancer Res，1997，57（14）：2916-2921.

［8］黄茂，范文辉，殷凯生.木犀草素抑制支气管哮喘气道重塑的作用［J］.中国临床康复，2006，10（47）：82-84.

［9］FORMICA J V，REGELSON W.Review of the biology of quercetin and re-lated bioflavonoids［J］.Food Chem oxicol，1995，33（12）：1061-1080.

［10］FOTSIS T，PEPPER M S，AKATAS E，et al.Flavonoids，dietaryderived inhi-bitors of cell proliferation and in vitro angiogenesis［J］.Cancer Res，1997，57（14）：2916-2921.

［11］UEDA H，YAMAZAKI C，YAMAZAKI M.A hydroxyl group of flavonoids afects or ala nti.inflammatory activity and inhibition of systemic tumornecrosisfactor-alphaproduction［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2004，68（1）：119-125.

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［13］谢惠民.合理用药［M］.北京：人民卫生出版社，1989：627.

Retention Enama treatment with Luteolin suppresses interferon gamma and interleukin 4 Levels in asthma mice model

HONG Lijun，WEI Guangzhou，CHEN Zuren，LIU Kexin*，ZHANG Yongzheng，WANG Fang，WANG Congli
（Mudanjiang City Hospital of Traditional Chinese Medicine，Mudanjiang 157000，Heilongjiang Province，China）

ObjectiveTo explore the influence of luteolin retention enema on interferon rats serum in rat asthma model of gamma（IFN-gamma）and interleukin 4（IL-4）.MethodsThe 80 male and female SD rats were divided into blank group，model group，gavage group，retention enema group，with 20 rats in each group.IFN-gamma and IL-4 content in serum were tested by method of ELISA.Rats in the lung tissue of rat asthma model change were observed under the microscope.ResultsCompared with the model group，clysis group and the oral group could significantly increase the content of serum gamma IFN-in bronchial asthma rats，and decreased the content of IL-4.Significant differences（P＜0.01）.Enema group and oral group histopathological observation of lung tissue infiltration is reduced，the smooth muscle wall thickness reduction，reduced tissue edema and congestion phenomenon.ConclusionLuteolin retention enema can reduce asthma in young rats serum IL-4 and IFN-content increased gamma.

Luteolin；asthma；IF-4；INF-γ；retention enama；mice

R285.5

A

1003-5699（2015）09-0938-04

：张瑞彬

2014-12-15）

10.13463／j.cnki.jlzyy.2015.09.022

黑龙江省卫生计生委科研课题（2014-084）。

洪丽军（1955-），女，主任医师，主要从事儿科常见病及疑难病治疗研究。

*通信作者：刘克新，电话-18204637111，电子信箱-honglijhlj112＠126.com