TRAIL、MAP-2和Nestin在流产患者绒毛组织中的表达及意义

朱旅聪，刘学红，张泳，何淑英

（1.绍兴文理学院附属医院，浙江绍兴312000；2.绍兴文理学院医学院，浙江绍兴312000；3.绍兴市计划生育宣传技术指导站，浙江312000）

TRAIL、MAP-2和Nestin在流产患者绒毛组织中的表达及意义

朱旅聪1，刘学红2，张泳2，何淑英3

（1.绍兴文理学院附属医院，浙江绍兴312000；2.绍兴文理学院医学院，浙江绍兴312000；3.绍兴市计划生育宣传技术指导站，浙江312000）

目的探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）、微管相关蛋白2（MAP-2）和巢蛋白（Nestin）与自然流产和人工流产绒毛发育的关系。方法选择2007年6月至2008年6月在浙江省绍兴市计划生育宣传技术指导站门诊接受自然流产的患者40例及同期进行人工流产的患者60例（作为对照）。应用免疫组化法检测第40～90天自然流产和人工流产患者胎盘绒毛和蜕膜组织中TRAIL、MAP-2和Nestin的表达，并分析其分布规律。结果妊娠第40～90天人工流产患者绒毛和蜕膜组织中少数细胞TRAIL呈阳性表达，自然流产患者绒毛和蜕膜组织中多数细胞TRAIL呈阳性表达；人工流产患者绒毛组织中MAP-2呈阴性表达，自然流产患者绒毛组织中MAP-2呈广泛阳性表达；人工流产患者绒毛组织中位于绒毛腔、紧靠细胞滋养层血管内皮细胞Nestin呈阳性表达，自然流产患者绒毛腔内仅少量血管内皮细胞Nestin呈弱阳性表达。结论TRAIL、MAP-2和Nestin的表达状况与绒毛组织细胞发育及妊娠关系密切。

流产，自然；绒毛膜；微管相关蛋白质类；TNF相关凋亡诱导配体；免疫组织化学

自然流产是常见妊娠并发症，在育龄妇女中发病率高，其中不明原因自然流产占自然流产发生率的50%。胎盘是胎儿与母体的接触面，绒毛的正常发育是胚胎正常发育的前提和关键。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand，TRAIL）及其受体在调节母胎界面细胞凋亡、维持母胎界面免疫耐受中具有重要作用[1-2]。微管相关蛋白 2（microtubules related protein 2，MAP-2）作为细胞内骨架蛋白，参与了细胞分化、发育及衰老过程，反映细胞内微管的变化状况[3-4]。巢蛋白（Nestin）作为干细胞标记蛋白分子，反映细胞的增殖、分化状况[5]。目前，TRAIL、MAP-2和Nestin广泛应用于临床肿瘤和神经系统退行性疾病的研究[6-9]，但有关TRAIL、MAP-2和Nestin与流产关系的研究较少。本研究联合应用TRAIL、MAP-2和Nestin 3种蛋白研究其在人工流产和自然流产胎盘组织中的表达及分布规律，旨在探索自然流产等病理性妊娠的发生机制，为自然流产的诊治提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2007年6月至2008年6月在浙江省绍兴市计划生育宣传技术指导站门诊接受自然流产的患者40例及同期进行人工流产的患者60例（作为对照）。患者年龄20～35岁，身体健康，月经规律（月经周期28～30 d），经妇科检查均排除阴道炎、宫颈糜烂和宫颈息肉等其他妊娠并发症，3个月内未服用甾体类药物，未放置宫内节育器。经妇科、B超检查证实为宫内妊娠且符合孕周（第40～90天）。

1.2 方法

1.2.1 取材 吸宫术后分别迅速取大小0.5 cm×0.5 cm胎盘绒毛、蜕膜组织放于预先配好的10%中性甲醛水溶液（pH=7.4）内固定4～6 h后脱水、包埋，制成蜡块。

1.2.2 免疫组化染色 将制备好的各组绒毛和蜕膜组织蜡块进行石蜡切片，厚4 μm，每例标本取8片，进行免疫组化染色[TRAIL山羊抗人多克隆抗体、MAP-2和 Nestin小鼠抗人单克隆抗体（一抗）及其辅助试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司]。TRAIL免疫组化染色采用SP法，即切片常规脱蜡至水，微波抗原修复，3%过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）灭活内源性酶，正常山羊血清封闭，滴加一抗（1∶100）及生物素化山羊抗兔血清（二抗），滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，在以上各步骤之间均用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）洗涤3次，每次5 min；二氨基联苯胺（3，3′-diaminobenzidine，DAB）显色，用自来水冲洗，苏木精轻度复染，然后脱水，透明，中性树胶封片，显微镜观察。MAP-2和Nestin免疫组化染色采用PV法，即切片常规脱蜡至水，微波抗原修复，3%H2O2灭活内源性酶，滴加一抗（1∶130）及PV6002，DAB显色，在以上各步骤之间均用PBS洗涤3次，每次5 min；苏木精轻度复染，然后脱水，透明，中性树胶封片，显微镜观察。

2 结 果

2.1 免疫组化染色结果 切片经染色后TRAIL、MAP-2和Nestin表达阳性细胞的细胞质/膜呈淡黄色、黄色或褐黄色，细胞核不着色。妊娠第40～90天人工流产患者绒毛组织的合体滋养层和细胞滋养层细胞发育正常，细胞排列整齐，结构完整；自然流产患者绒毛组织完整结构受到不同程度破坏，绒毛组织的合体滋养层细胞不完整或缺失。

2.2 TRAIL在绒毛和蜕膜组织中的表达 妊娠第40～90天人工流产患者绒毛和蜕膜组织内少数细胞TRAIL呈阳性表达，自然流产患者绒毛和蜕膜组织内多数细胞TRAIL呈阳性表达，且阳性表达与孕龄无关，见图1～4。

2.3 MAP-2在绒毛组织中的表达 妊娠第40～90天人工流产患者绒毛组织中MAP-2呈阴性表达，见图5；自然流产患者绒毛组织中MAP-2呈广泛阳性表达，见图6。

图1 妊娠第65天人工流产患者绒毛组织中TRAIL呈阳性表达（SP，400×）

图2 妊娠第65天自然流产患者绒毛组织中TRAIL呈阳性表达（SP，400×）

图3 妊娠第45天人工流产患者蜕膜组织中TRAIL呈阳性表达（SP，400×）

图4 妊娠第45天自然流产患者蜕膜组织中TRAIL呈阳性表达（SP，400×）

图5 妊娠第74天人工流产患者绒毛组织中MAP-2呈阴性表达（PV，400×）

图6 妊娠第74天自然流产患者绒毛组织中MAP-2呈阳性表达（PV，400×）

2.4 Nestin在绒毛组织中的表达 妊娠第40～90天人工流产患者绒毛组织中位于绒毛腔、紧靠细胞滋养层血管内皮细胞Nestin呈阳性表达，见图7；自然流产患者绒毛腔内仅少量血管内皮细胞Nestin呈弱阳性表达，见图8。

图7 妊娠第60天人工流产患者绒毛组织中Nestin呈阳性表达（PV，400×）

图8 妊娠第60天自然流产患者绒毛组织中Nestin呈弱阳性表达（PV，400×）

3 讨 论

正常妊娠者胎盘绒毛和蜕膜组织中存在细胞凋亡和细胞增殖的动态平衡过程，若细胞凋亡异常增高打破这一平衡状态将会引发自然流产。TRAIL参与了肿瘤的发病机制、感染性疾病的炎症过程、胚胎组织的发育过程、组织细胞凋亡调控过程等，尤其在胚胎植入过程中TRAIL在诱导子宫内膜腔上皮细胞、蜕膜细胞及滋养层细胞的凋亡过程中具有重要作用[10-12]。TRAIL基因是肿瘤坏死因子家族新成员，与FasL具有高度同源性，定位于人类染色体3q26，包含281个氨基酸的Ⅱ型跨膜蛋白，目前发现，其有DR4（TRAILR1）、DR5（TRAILR2）、DcR1（TRAILR3）、DcR2（TRAILR4）和骨保护素（TRAILR5）5种受体，各自具有不同的生物学活性并发挥不同作用[13]。本研究结果显示，TRAIL在自然流产患者绒毛和蜕膜组织中阳性表达强于人工流产患者。与高巍等[14]报道的“反复自然流产组绒毛组织中TRAIL表达较强”的结果基本一致。张晋平等[15]报道，TRAIL具有将蜕膜基质细胞阻滞在G0/G1期、抑制蜕膜基质细胞增殖并促使其凋亡的功效。说明在胚胎正常发育阶段胎盘作为胎儿与母体间进行物质转运、免疫调节和生物合成的重要器官，不仅是产生TRAIL的场所，也是TRAIL的靶器官。少量的TRAIL表达，诱导胎盘绒毛和蜕膜组织细胞对抗凋亡，维持正常发育。当自然流产发生，迅速启动了TRAIL诱导细胞凋亡通路，诱发大量细胞凋亡。

细胞骨架在维持细胞形态、物质转运、细胞分裂、细胞运动及细胞内外信息传递功能方面具有非常重要的作用。MAP-2作为细胞骨架系统重要成分之一，是一种高度保守蛋白，在维持微管动力学稳定等方面发挥重要作用。本研究结果显示，妊娠第40～90天人工流产患者绒毛组织中MAP-2呈阴性表达，自然流产患者绒毛组织中 MAP-2呈广泛阳性表达。说明妊娠第40～90天胎盘绒毛和蜕膜组织中细胞微管聚合及解聚活动能力相对较弱，与早期绒毛侵袭性生长比较，该期绒毛生长能力明显下降，处于相对静止状态。当自然流产发生后胎盘绒毛和蜕膜组织中细胞受到TRAIL等各种凋亡信号的调控，细胞中维持细胞形态的微管等细胞骨架成分发生改变。吴旭等[16]报道，MAP-2 mRNA在大鼠脑损伤后30 min表达增强，伤后2d达峰值，并维持高水平表达至伤后7d。钱军等[17]报道，大鼠脊髓损伤后损伤区MAP-2表达先降低后升高，可能与损伤后突触结构重建及受损神经功能代偿和修复作用有关。MAP-2在自然流产患者绒毛组织中表达增强，提示自然流产患者绒毛和蜕膜组织可能也存在与神经细胞相同的损伤修复过程。

Nestin属第Ⅵ类中间丝蛋白，与细胞骨架形成、细胞信号转导等有关，参与定位和运行亚细胞器，调节细胞增殖、生存和分化。本研究结果显示，妊娠第40～90天人工流产患者绒毛组织中大量血管内皮细胞Nestin呈阳性表达。Suzuki等[18]报道，Nestin在血管内皮祖细胞中表达而在成熟的血管内皮细胞中不表达，并认为Nestin可作为新生血管的标志蛋白。说明妊娠第40～90天绒毛组织中仍有部分血管处于发育形成阶段，该期绒毛组织较脆弱。而同期自然流产患者绒毛组织中血管内皮细胞Nestin阳性表达少且弱。说明绒毛组织细胞受到外界或内在因素影响，多条细胞凋亡通路启动，绒毛组织中新生血管内皮祖细胞能力下降，新生血管数量减少，组织缺血、缺氧，影响了胚胎发育，诱发自然流产。

总之，TRAIL、MAP-2和Nestin表达状况与绒毛组织细胞发育及妊娠发展关系密切。

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Expression and significance of TRAIL，MAP-2 and Nestin in chorionic villus tissue of abortion patients

Zhu Lvchong1，Liu Xuehong2，Zhang Yong2，He Shuying3
（1.Affiliated Hospital of Shaoxing University，Shaoxing，Zhejiang 312000，China；2.Medical College of Shaoxing University，Shaoxing，Zhejiang 312000，China；3.Shaoxing Municipal Guidance Station of Family Planning Publicity Technique，Zhejiang 312000，China）

ObjectiveTo investigate the relationship between TNF-related apoptosis inducing ligand（TRAIL），microtubules related protein 2（MAP-2）and Nestin with chorionic villus development in the spontaneous abortion and artificial abortion．Methods40 cases of spontaneous abortion and contemporaneous 60 cases of artificial abortion as the controls in the outpatient department of the Shaoxing Municipal Guidance Station of Family Planning Publicity Technique were selected and detected the expressions of TRAIL，MAP-2 and Nestin in the decidual and chorionic villus tissues on pregnant 40-90 d by using the immunohistochemistry.The distribution rule was analyzed.ResultsTRAIL was positively expressed in the minority cells of the decidual and chorionic villus tissues on pregnant 40-90 d in the patients with artificial abortion，while the majority cells of the decidual and chorionic villus tissues in the patients with spontaneous abortion showed the TRAIL positive expression；MAP-2 was negatively expressed in the chorionic villus tissue of the patients with artificial abortion，but MAP-2 showed extensively positive expression in the chorionic villus tissue of the patients with spontaneous abortion；Nestin was positively expressed in the intervillous lacuna and close to cytotrophoblast vascular endothelial cells of the patients with artificial abortion，while Nestin showed weakly positive expression only in minority vascular endothelial cells of the intervillous lacuna in the patients with spontaneous abortion.ResultsThe expressional situation of TRAIL，MAP-2 and Nestin in the decidual and chorionic villus tissues is closely related to the chorionic villus tissue cell development and pregnancy.

Abortion，spontaneous；Chorion；Microtubule-associated proteins；TNF-related apoptosis-inducing ligand；Immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.17.001

A

1009-5519（2015）17-2569-03

2015-04-22）

浙江省教育厅项目（Y201328640）；浙江省绍兴市哲学科学规划项目（125071）。

朱旅聪（1990-），女，浙江仙居人，主要从事早期妊娠及放射医学方面的研究；E-mail：644921468@qq.com。

张泳（E-mail：hhren6588@sina.com）。