NGX6基因联合顺铂治疗肺癌的体内外研究

张敬，王哲，史晓宇，孟玮，马峰，王金，赵永明

(1.河北北方学院附属第一医院 肿瘤内科，河北 张家口 075000；2.河北北方学院附属第一医院 泌尿外科，河北 张家口 075000；3.河北北方学院 药学系，河北 张家口 075000)



NGX6基因联合顺铂治疗肺癌的体内外研究

张敬1，王哲2，史晓宇1，孟玮1，马峰1，王金3，赵永明3

(1.河北北方学院附属第一医院 肿瘤内科，河北 张家口 075000；2.河北北方学院附属第一医院 泌尿外科，河北 张家口 075000；3.河北北方学院 药学系，河北 张家口 075000)

目的 探讨NGX6基因联合顺铂对肺癌A549细胞和NCI-H1975细胞的体外抑制作用及其体内抗肿瘤效果。方法 以脂质体鱼精蛋白为载体，构建载NGX6基因的阳离子脂质体-DNA复合物。将A549细胞和NCI-H1975细胞均分为NGX6组(载NGX6基因的LPD，NGX6浓度为30 μg/mL)、顺铂组、NGX6+顺铂组，以PBS为阴性对照。采用MTT检测各组对A549细胞和NCI-H1975细胞的生长抑制作用；克隆形成实验计算克隆形成率和抑制率；构建肺癌移植肿瘤模型，将裸鼠分为同细胞处理相同的4组, 每组10只，统计各组裸鼠肿瘤体积和生存期，观察各组裸鼠肿瘤组织细胞凋亡情况。结果 对肿瘤细胞的增殖抑制能力显著强于NGX6组和顺铂(P<0.01)。克隆形成实验结果表明，NGX6+顺铂组的肿瘤细胞克隆数小于NGX6组和顺铂组(P<0.01)。体内抗肿瘤实验结果表明，NGX6+顺铂组对荷瘤裸鼠的肿瘤生长抑制率显著高于NGX6组和顺铂组(P<0.01)。NGX6+顺铂组，NGX6组，顺铂组和生理盐水组荷瘤裸鼠的中位生存期分别为43、31、29、15d。结论 NGX6基因联合顺铂能够有效抑制肺癌细胞的增殖和肿瘤的生长。表明基因干预联合细胞毒性药物化疗能为肿瘤的治疗提供了一种新的治疗手段。

NGX6基因；肺癌；顺铂；A549细胞；NCI-H1975细胞；体内；体外

肺癌是当前威胁人类的头号肿瘤疾病。我国每年的肺癌新增患者超过50万,到了2025年,这一数字将会突破100万[1]。当前肺癌的治疗以手术为主,放化疗为辅。依托泊苷和多西紫杉醇[2]与阿霉素[3],顺铂[4]等是当前肺癌治疗的常规化疗药物。然而由于化疗药物的强烈不良反应,且容易产生耐药性,导致肺癌的治疗研究进展缓慢[5]。因此需要探索新的肺癌治疗手段。

基因治疗是当前肿瘤治疗研究的热点。NGX6基因是近年来研究发现的内源性基因片段,它是一种肿瘤抑制基因,能够有效的抑制肿瘤的发展[6]。有研究表明,NGX6基因能够有效抑制鼻咽癌细胞的增殖和结肠癌的发展和转移[7]。本研究旨在探讨NGX6基因联合顺铂对肺癌细胞的增殖抑制能力和对肺癌荷瘤裸鼠的体内抑制效果。

1 材料与方法

1.1 细胞 人源性A549肺癌细胞和NCI-H1975细胞购自美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC)。

1.2 实验动物 4周龄的雄性成年裸鼠50只(约20～25 g,河北医科大学实验动物中心,动物合格证号：2014A028；许可证号：HBYD2013-011)。动物实验遵循《实验动物保护条例》。

1.3 药品与试剂 胎牛血清(杭州四季青生物科技有限公司)；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(2- distearoyl phosphatidylethanolamine,DSPE),2-二油酰基羟丙基-3-N,N,N-三甲铵(1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propane,DOTAP，美国avanti公司)；NGX6基因( Naso Phngeal carcinoma associated gene 6,北京中原公司)；1640培养基[赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司]；空白脂质体(美国invitrogen公司)；鱼精蛋白(碧云天生物研究所)；MTT试剂盒(美国sigma公司)；硝酸纤维素膜(Amersham Pharmacia 公司)；顺铂(江苏恒瑞医药股份有限公司)；其余试剂为分析纯。

1.4 仪器 SkanIt生物发光仪(Thermo，美国)； 流式细胞分析仪(FC-500，BECKMAN COULTER，美国)；酶标仪(Varioskan Flash，热电，美国)；光学显微镜(奥林巴斯SZ51/SZ61，日本)

1.5 方法

1.5.1 脂质体-鱼精蛋白-DNA的制备：参照Leaf Huang的方法[8-9]制备脂质体-鱼精蛋白-DNA复合物。取适量DSPE和DOTAP，用氯仿溶解,至于茄形瓶中,旋转蒸发仪除去有机溶剂，在瓶底形成透明脂质薄膜，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer,PBS)水化后得到空白阳离子脂质体。将阳离子脂质体与鱼精蛋白混合孵育后得到脂质体-鱼精蛋白复合物,再加入等体积的NGX6基因共同孵育后得到载NGX6基因的脂质体-鱼精蛋白-DNA复合物(liposome protamine complexes DNA,LPD)。

1.5.2 MTT实验：将A549细胞和NCI-H1975细胞按1500个/孔的密度接种于96孔细胞板中,在37 ℃、5% CO2及饱和湿度条件下培养24 h,待细胞完全贴壁生长后,更换孔内培养基,每个细胞孔加入170 μL新鲜含血清培养基,然后分别加入载NGX6基因的LPD(NGX6浓度为30 μg/mL)100 μL为NGX6组,顺铂注射液(3 μg/mL)100 μL为顺铂组,NGX6和顺铂各100 μL为NGX6+顺铂组,以PBS为阴性对照组。将细胞板置于37℃,5% CO2条件下孵育24,48和72 h后,吸出孔板内液体,每孔内加入5 mg/mL MTT-PBS溶液20 μL,37 ℃、5%CO2,孵育4 h,小心吸出孔板内液体,每孔加入200 μL DMSO溶解生成的甲臜,放置孔板于摇床中,37 ℃,75 r/min,20 min孵育,取出晾冷至常温后,用SkanIt生物发光仪检测各孔在490 nm处的OD值,每组设置5个复孔。

1.5.3 克隆形成实验：取对数生长期的A549细胞和NCI-H1975细胞悬液接种于6孔板中。每组设6个复孔。培养24 h后按照1.5.2项下给药培养24 h,弃去药液,换新鲜培养基。 15 d 后甲醇固定,结晶紫染色,显微镜下计数细胞集落。计算克隆形成率和抑制率。

1.5.4 肺癌移植瘤模型的构建：建立A549肿瘤动物模型,注射100 μL含2×106个A549细胞的PBS于小鼠背部皮下,12～14 d后,背部肿瘤直径达到10～14 mm,可用于后续试验。肿瘤体积每隔2天测一次,计算公式：肿瘤体积=0.5×长轴×短轴2。小鼠体质量每2天测一次。当肿瘤体积到大约 100 mm3时,将小鼠分为4组,即：PBS组、NGX6组(载NGX6的LPD，NGX6浓度为30 μg/mL)、顺铂组(3 μg/mL)和LPD+顺铂组,每组10只裸鼠。统计各组裸鼠的肿瘤体积和生存期,裸鼠死亡后,取肿瘤组织切片,Tunel染色于光学显微镜下观察。

2 结果

2.1 NGX6基因联合顺铂对A549细胞和NCI-H1975细胞的增殖抑制作用 与PBS组比较各给药组均能抑制肺癌细胞的增殖,差异有统计学意义(P<0.01)。各给药组对肿瘤细胞的增殖抑制作用具有时间依赖性,药物对细胞增殖的抑制作用随着时间的延长而增强。在相同的孵育时间下,NGX6+顺铂组对A549细胞和NCI-H1975细胞的增殖抑制作用显著强于NGX6组和顺铂组(P<0.01)。见图1,图2。

图1 NGX6基因联合顺铂对A549细胞和NCI-H1975细胞的增殖抑制作用(n=5)**P<0.01,与同时间的PBS,NGX6和顺铂组比较；**P<0.01，与24 h和48 h的NGX6联合顺铂组比较Fig.1 The inhibition rate of A549 cells and NCI-H1975 cells by NGX6 combine with cisplatin(n=5)**P<0.01，compared with PBS,NGX6 and cisplatin at the same time；# P<0.01,compared with NGX6+cisplatin at 24 h and 48 h

2.2 NGX6基因联合顺铂对肺癌细胞克隆率的影响 NGX6组,顺铂注射液组和(NGX6+顺铂)组对A549细胞和NCI-H1975细胞的克隆形成均有抑制作用,与PBS组相比较差异均有统计学意义(P<0.01),其中(NGX6+顺铂)组克隆数较NGX6组,顺铂注射液组差异有统计学意义(P<0.01)。见表1、表2。

表1 各组对A549细胞克隆形成的抑制情况±s,n=6)Tab.1 Inhibition of different group on the clones of A549 ±s,n=6)

**P<0.01,与PBS组比较,compared with PBS group；#P<0.01,与NGX6组和顺铂组比较,compared with NGX6 group and cisplatin group

表2 各组对NCI-H1975细胞克隆形成的抑制情况Tab.2 Inhibition of different group on the clones of NCI-H1975 ±s,n=6)

**P<0.01,与PBS组比较,compared with PBS group；#P<0.01,与NGX6组和顺铂组比较, compared with NGX6 group and cisplatin group

2.3 NGX6基因联合顺铂对肺癌移植瘤的生长抑制作用 截止第18天，联合干预组对荷瘤裸鼠的肿瘤生长抑制率显著高于NGX6基因干预组和顺铂干预组,差异有统计学意义(P<0.01)；NGX6基因干预组和顺铂干预组对肿瘤生长抑制率强于生理盐水组，差异有统计学意义(P<0.01)。见图2。

图2 不同药物干预后肿瘤体积变化(n=10)*P<0.01，与PBS组比较；#P<0.01，与NGX6组和顺铂组比较Fig.2 The change rate of the volume of tumor with the interference of different drugs(n=10)*P<0.01，compared with PBS group; #P<0.01，compared with NGX6 group and cisplatin group

联合干预组,NGX6基因干预组,顺铂干预组和生理盐水组的荷瘤裸鼠的中位生存期分别为43、31、29、15d, 联合干预组对延长荷瘤裸鼠中位生存期作用显著强于NGX6基因干预组和顺铂干预组，差异有统计学意义(P<0.01)；与生理盐水组比较，联合干预组,NGX6基因干预组和顺铂干预组都能延长荷瘤裸鼠中位生存期(P<0.01)。见图3。

图3 不同药物干预组荷瘤裸鼠的生存曲线Fig.3 The Kaplan-Meier curve of different group

肿瘤组织切片Tunel染色结果显示,联合干预组肿瘤组织出现大量坏死,细胞凋亡增加。见图4。

图4 不同药物干预组肿瘤组织切片TUNEL染色(×200)A.PBS组；B.NGX6组；C.顺铂组；D.NGX6+顺铂组Fig.4 TUNEL staining of different tumor tissue with the interference of different drugs(×200)A.PBS group;B.NGX6 group;C.cisplatin group;D.NGX6+ cisplatin group

3 讨论

肺癌是全球最普遍发生的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率居全球恶性肿瘤之首[10]。现在,虽然化疗和放疗能够减小整个肿瘤的体积,是肺癌主要治手段,然而这种治疗对于肿瘤的杀伤是非特异性的,以至于肿瘤的复发和耐药性的产生[11]。同时当前肺癌所采用的放疗和化疗较严重的副作用,导致肺癌患者生存率低,生活质量差[12]。因此研究新的肺癌治疗方法显得十分重要。NGX6基因是近来发现的一组能够抑制肿瘤发展的抑癌基因,研究表明,它在包括鼻咽癌[7],结肠癌[13]等肿瘤中表达下调。有研究显示将NGX6基因通过质粒或者脂质体载药系统转染肿瘤细胞后,肿瘤细胞的增殖,生长和侵袭受到抑制[14]。顺铂是目前临床上常用的一种肺癌化疗药物,然而其常常会产生骨髓抑制,胃肠道反应以及神经毒性等副作用[15]。本研究将NGX6基因与顺铂联合应用于抗肺癌研究,以期为基因联合化疗治疗肺癌提供实验基础。

本研究采用目前常用的LPD载体包载NGX6基因,可以避免NGX6基因被血液和组织中的核酸酶降解,能够有效提高NGX6基因的稳定性。MTT实验证实,NGX6基因能够有效抑制肺癌A549细胞和NCI-H1975细胞的增殖。这说明NGX6基因能够调控肺癌细胞的增殖,是肺癌的抑癌基因。同时,研究发现NGX6基因联合顺铂能够增强对肺癌细胞的增殖抑制能力,2者具有协同作用。细胞克隆形成实验证实NGX6基因联合顺铂能够有效抑制肺癌的发展。本研究还通过体内实验证实,NGX6基因联合顺铂能够有效抑制肺癌荷瘤裸鼠肿瘤的生长,延长荷瘤裸鼠的中位生存期。

综上所述,NGX6基因联合顺铂对肺癌细胞具有显著的抑制作用,对裸鼠肺癌移植瘤具有高效的生长抑制作用。NGX6基因联合顺铂是一种潜在的肺癌治疗手段。

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(编校：王冬梅)

NGX6 gene combined with cisplatin in treatment of lung cancer in vitro and in vivo

ZHANG Jing1, WANG Zhe2, SHI Xiao-yu1, MENG Wei1, MA Feng1, WANG Jin3, ZHAO Yong-ming3

(1.Department of Oncology, The First Attached Hospital of Hebei Northern University, Zhangjiakou 075000, China; 2.Department of Urology, The First Attached Hospital of Hebei Northern University, Zhangjiakou 075000, China; 3.Department of Pharmacy, Hebei North University, Zhangjiakou 075000, China)

ObjectiveTo evaluate the effect of NGX6 combined with cisplatin on the inhibition rate of A549 cells and NCI-H1975 cells and antitumor effects in vivo.MethodsThe NGX6 was loaded in the LPD, and prepare Liposome protamine DNA complexes.A549 cells and NCI-H1975 cells were seperately divided into NGX6 group(30 μg/mL NGX6 concentration), cisplatin group,NGX6+cisplatin group,PBS as negative control group.The effect of cytotoxicity of four group on A549 cells and NCI-H1975 cell were evaluated by MTT assay.the clone forming rate and the inhibition rate were determined by Cell colony count.lung transplantation tumor model were successfully established, then nude mice were divided into four groups as abeve, each group of 10, tumor size and survival period were determined tumor cell apoptosis were observed.ResultsThe cell viability of A549 cells and NCI-H1975 cells of (NGX6 + cisplatin) were lower than that of NGX6 group, cisplatin group and saline group, respectively(P<0.01).The cloning efficiency of A549 cells and NCI-H1975 cells of (NGX6 + cisplatin) were lower than that of NGX6 group, cisplatin group and saline group, respectively(P<0.01).The tumor inhibitory rate was in vivo for (NGX6 + cisplatin) was higher than other group(P<0.01).The median survival of nude mice in (NGX6 + cisplatin), NGX6, cisplatin and saline group were 43,31,29 and 15 days.ConclusionNGX6 combination with cisplatin can inhibit the cell proliferate of lung cancer cells and inhibit the tumor growth and the combination of NGX6 and cisplatin may be a potentially effective treatment for lung cancer.

NGX6; lung cancer;cisplatin; A549 cells ; NCI-H1975 cells ;in vitro; in vivo

张家口市2013年度科学技术研究与发展计划(1321099D)

张敬，女，硕士,主治医师,研究方向：肺癌治疗的基础与临床研究，E-mail:zhangjingbfxy@163.com。

R734.2

A

1005-1678(2015)05-0033-04