人参多糖对秀丽线虫polyQ聚集毒性和寿命的影响

陈佩雷,潘建春

(1.温州医科大学附属乐清医院 临床药学室，浙江 乐清 325600；2.温州医科大学 药学院，浙江 温州 325035)



人参多糖对秀丽线虫polyQ聚集毒性和寿命的影响

陈佩雷1,潘建春2Δ

(1.温州医科大学附属乐清医院 临床药学室，浙江 乐清 325600；2.温州医科大学 药学院，浙江 温州 325035)

目的 探讨人参多糖对秀丽线虫polyQ聚集毒性和寿命的影响。方法 将秀丽线虫HA759和AM141各分成2组，Control组和Ginseng组。Control组，不做任何特殊处理，Ginseng组将10 mg/mL中药多糖与 OP50-1按照 1:4 的比例混合至总体积 50 mL后加入秀丽线虫培养平皿。观察秀丽线虫HA759 ASH 神经元的存活状况；每天取样统计秀丽线虫AM141周身聚集荧光点数；研究2种秀丽线虫的寿命。结果 研究表明，培养3 d后Control组 HA759秀丽线虫ASH 神经元存活率为53%，Ginseng组ASH 神经元存活率为64%，2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。Control组AM141秀丽线虫在生长发育中，其体壁细胞中的聚集点逐渐增多，48、72、96 h的荧光聚集点数分别为(6±1)、(27±2)、(56±4)个。Ginseng组秀丽线虫荧光点数在48 h为(4±1)个，72 h和96 h分别为(20±3)、(45±2)个，相比对照均有所下降(均P<0.05)。2种秀丽线虫存活时间从第5天开始即出现差异(P<0.05)，Control组AM141秀丽线虫平均存活时间为(23±2)d，Ginseng组为(27±2)d；Control组HA759秀丽线虫平均存活时间为(24±2)d，Ginseng组为(27±2)d。结论 人参多糖能延长秀丽线虫寿命，而抑制 polyQ聚集并缓解与衰老相关的 polyQ 神经毒性。

人参多糖；秀丽线虫；神经毒性；寿命

在世界人口老龄化的21世纪，患与衰老相关的神经退行性疾病的人越来越多，由此给患者家庭和社会带来沉重负担[1]。预计2050年，世界范围内患有此类疾病的患者将达到1 亿，而目前人类还不能科学系统的阐明此类疾病的发病机理，也没有有效的治疗途径，因此加强对衰老相关的神经退行性疾病的研究成为医疗机构和制药行业高度重视的重大科学任务[2]。衰老促发了一系列衰老相关的疾病，蛋白聚集毒性是衰老相关神经退行性疾病的主要病理特征[3]。人参多糖在抗衰老及衰老相关疾病方面具有独特优势，但其能否缓解神经退行性疾病中的蛋白毒性？本文旨在通过秀丽线虫模型来探讨人参多糖对秀丽线虫polyQ聚集毒性和寿命的影响。

1 材料与方法

1.1 药材与菌株 人参(PanaxginsengC.A.mey)购自亳州康圣药业有限公司，产地东北，批号20120201。

AM141、HA759秀丽线虫株以及OP50-1来源于中南大学秀丽线虫遗传中心。

1.2 试剂 琼脂57-50-1 CP(日本广野株式会社)；琼脂糖(OXOID)；Trizol Agent(Invitrogen)；SYBR Green1 QPK-201(TOYOBO)；SYBR Green Master (Rox) 049138500， (Roche)；Quanti Test SYBR Green PCR kit(Qiagen)；100bp DNA ladder MD109(Tiangen)；DEAE-Sepharose FAST Flow 500Ml(Amersham Biosciences)；Goldview 电泳染色剂MN407 (博大泰克)；其余试剂均为国产分析纯。

1.3 实验仪器 BSC 系列生物安全柜 BES-13611A2(北京东联哈尔仪器制造有限公司)；AIR TECH 洁净工作台SW-CJ-1FD(苏净集团苏州安泰空气技术制造公司)；PCR 仪(Tpersonal Biometra)；定量 PCR BIORAD(联想生物技术有限公司)；高速离心机1-14(Sigma)；AllegraX-30R centrifuge ALZ11L080(BECKMAN COULTER)；酶标仪 RS-232C MK3(Thermo Labsystems)；荧光酶标仪(Thermo)；电泳仪DYY-6C，紫外仪 WD-9403D，电泳槽 DYCP-33A(北京市六一仪器厂)。

1.4 方法

1.4.1 秀丽线虫的培养、转接和同步化：采用固体NGM培养基培养线虫。

传代线虫采用琼脂快转接法；转接大量线虫采用M9洗涤法；单个秀丽线虫的转接用铂金丝挑取线虫到新的 NGM板里。秀丽线虫的同步化培养：L4期线虫拥有明显的生理学特征，在实验中可以客观地辨别，因此可采用挑取线虫法来得到同步化虫子。将产卵高峰的秀丽线虫置于新的含有食物菌苔的平皿中，让其产卵 3～4 h，再将成虫移走，将带有虫卵的平皿置于20 ℃培养，待平皿中卵孵化后，便可得到同步化效果的线虫。

1.4.2 秀丽线虫的多聚谷氨酰胺聚集毒性实验：琼脂糖垫制备：称取1 g琼脂糖，加入50 mL S·Medium，解冻状态下微波加热5 min，使其完全融化呈透明液体，然后将一块载玻片(厚度约为 1 mm)放在两块玻璃板(厚度约为 2 mm)之间，趁热吸取0.5 mL琼脂糖滴在载玻片的中央，随即从一侧轻轻盖上另一块载玻片，待琼脂糖冷去凝固后，小心移走上层载玻片，下层载玻片中央即成厚度约为 1 mm的圆形琼脂糖垫，可用于固定秀丽线虫。

HA759秀丽线虫的准备：按照上述方法获得所需要的秀丽线虫，将L1期同步化的HA759线虫加入到给药平皿里，15 ℃生化培养箱培养3 d。

神经元存活统计：用 M9 溶液洗固体平皿，收集秀丽线虫于 1.5 mL离心管中，室温3500 r/min离心1 min，弃上层溶液，重复此步骤 2次，最后用M9定容至50 μL，加入10 μL 20 mM NaN3溶液麻痹秀丽线虫，混匀后取出 20 μL 滴加在制备好的琼脂糖垫上，盖上盖玻片，置于荧光显微镜下观察，ASH 和ASI神经元位于秀丽线虫咽部后两侧的神经元附件，经过3 d孵育，理论上ASH神经元仅存活10%[4]。而 ASI 神经元基本不衰亡，可以通过观察黄绿色荧光点来判断 ASH神经元状态。ASH神经元存活率(neuronal survival)计算公式如下：Neuronal survival(%)=[ Nsurvival/(Nsurvival+Ndead)]×100。公式中，Nsurvival和Ndead分别代表 ASH 神经元存活和死亡的秀丽线虫数目。

1.4.3 人参多糖对秀丽线虫模型中多聚谷氨酰胺的抑制作用：AM141 秀丽线虫模型(rm)是在其 unc-54基因上转入了融合YFP的40个多聚谷氨酰胺长度的polyQ重复片段(polyQ)构建而成。由于 unc-54是不协调基因，其本身表达在秀丽线虫肌球蛋白重链上，如果 polyQ 在其中表达则会导致polyQ 在体壁肌肉层聚集，导致因肌肉运动障碍而出现运动能力减退现象。由于是与 YFP融合，因而可以在荧光显微镜下观察到表现为黄绿色的荧光点。

将同步化的 L1 期线虫加入到给药的平皿中(10 mg/mL人参多糖)，生化培养箱 20 ℃培养4 d。第2天开始，每天收集1个给药平皿中的秀丽线虫；在荧光显微镜下统计秀丽线虫周身的荧光点数，如此连续统计3 d。

1.4.4 秀丽线虫的固体寿命实验 ：取10 mg/mL 的人参多糖，在旋转器上旋转促溶3 h，使其充分溶解后，过0.45 μm微孔滤膜除菌及不溶杂质。用S·Medium稀释成不同的人参多糖溶液：每次实验现用现配。实验分2组，Control组和Ginseng组。Control组，不做任何特殊处理，Ginseng组将药物(10 mg/mL人参多糖)与 OP50-1按照1:4的比例混合体积至 50 mL，将混合液加入平皿，轻轻晃动，使均匀分布于平皿中央。操作台中放置，使菌液充分被吸收，至不再流动。

准备实验所需L4期秀丽线虫：用铂金丝将10条产卵期的秀丽线虫转移到35 mm的玻璃平皿上，产卵3 h后，将虫子移走，将有虫卵的平皿20 ℃培养48 h 达到L4期，根据实验样本量，确定产卵期虫子个数。产卵期虫子平均每个虫子产卵6个/h。

上样：将L4期的虫子挑到铺好的平皿上，35～40条/板，每个组别分别做 3个平行平皿，使每组的样本量约为100条。20 ℃培养箱中培养。

培养和数据统计：产卵期的秀丽线虫，每天都要用铂金丝将线虫转移到新的平皿上；之后每隔1天转移1次。详细记录线虫的死亡个数及死亡状况(机械损伤、爬墙、内孵)。用铂金丝触之尾部，头部均不动者判断为死亡，每天统计，直至秀丽线虫全部死亡。

2 结果

2.1 人参多糖对多聚谷氨酰胺聚集毒性的影响 将同步化的L1期 HA759秀丽线虫加入到对照和给药平皿中，15 ℃培养3 d，荧光显微镜下统计荧光点。未经多糖处理的Control组 HA759秀丽线虫在培养3d后，ASH 神经元存活率为53%。Ginseng组HA759秀丽线虫ASH 神经元存活率有所提高，达到了64%，2组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。表明人参多糖具有缓解 polyQ 聚集介导的神经毒性作用。

图1 人参多糖对HA759秀丽线虫 ASH 神经元存活的影响*P<0.05，与control组相比Fig.1 Effect of ginseng on ASH neuron survival in HA759 model*P<0.05，compared with control group

2.2 人参多糖对多聚谷氨酰胺聚集的抑制作用 未经多糖处理的AM141秀丽线虫，在生长发育中其体壁细胞中的聚集点逐渐增多，48～96 h的荧光聚集点数分别为(6±1)、(27±2)、(56±4)个。加入100 μg/plate的人参多糖处理后，荧光点数在48 h为(4±1)个，在72 h和96 h分别为(20±3)、(45±2)个，相比对照均有所下降(P<0.05)，见图2、图3。结果表明，人参多糖对 AM141PolyQ 的聚集有一定的缓解作用。

图2 AM141秀丽线虫体壁细胞荧光点的表达情况Fig.2 AM141 C.elegans somatic cell fluorescence expression

图3 人参多糖对AM141秀丽线虫体壁荧光聚集点的影响*P<0.05，与control组相比Fig.3 Effect of ginseng polysaccharide on AM141 C.elegans somatic fluorescence point*P<0.05, compared with control group

2.3 人参多糖对Poly Q模型秀丽线虫寿命的影响 对AM141、HA759秀丽线虫以100 μg/plate剂量的人参多糖处理，观察其对秀丽线虫寿命的影响。从第5天开始，Control组和Ginseng组就出现明显差别；Control组AM141秀丽线虫平均存活时间为(23±2)d，Ginseng组AM141秀丽线虫平均存活时间为(27±2)d；Control组HA759秀丽线虫平均存活时间为(24±2)d，Ginseng组HA759秀丽线虫平均存活时间为(27±2)d，2组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图4 人参多糖对 AM141(A)和HA759(B)秀丽线虫寿命的影响Fig.4 Effect of ginseng polysaccharide on the lifespan of C.elegans AM141 (A) and HA759 (B)

3 讨论

衰老的特点是细胞内大分子，包括被自由基损伤蛋白质的不断积累[5]。随着机体衰老，细胞内氧化自由基的含量呈指数增加，蛋白质的这种不可逆氧化损伤也随着衰老恶化，相应的由此引发的神经毒性也随之加剧[6-8]。衰老是神经退行性疾病的高危因子，那么具有延缓衰老的药物是否可以缓解神经退行性疾病蛋白的毒性?文献报道，在秀丽线虫polyQ 蛋白聚集产生的毒性是有寿命依赖性的，同时，聚集引起的毒性又进一步加速衰老，此时，蛋白动态平衡总体表现出失调和紊乱的发展趋势[9-11]。胰岛素样信号是线虫寿命的主要调控者，对此通路进行遗传学操作以延长线虫寿命，polyQ聚集也会随之延迟[12]。研究表明，淀粉样蛋白结合染料硫磺素T能够延长秀丽线虫的寿命，稳定突变的亚稳态蛋白质和缓解Aβ 聚集毒性，还可以通过调控分子伴侣和蛋白质降解途径以减缓polyQ聚集[13]。

本研究发现，人参多糖缓解了polyQ 模型HA759线虫株中由polyQ异常聚集介导的神经毒性，减少了AM141 体壁细胞中PolyQ蛋白的聚集，说明人参多糖是通过减缓多聚谷氨酰胺的聚集起到神经保护作用的。最近研究表明，蛋白动态失衡不仅是经退行性疾病发生和发展的重要因素，也是衰老的主要特征，寿命调节相关信号是联系衰老、蛋白动态平衡以及神经退行性疾病这3者的重要桥梁[14-15]。而本文中人参多糖分别不同程度的延长 polyQ 秀丽线虫模型AM141及HA759的寿命，也证实了其增强机体维护蛋白平衡的能力。

本文以天然人参多糖为研究对象，利用模式生物秀丽线虫及现代生物学技术和方法，针对与衰老及衰老相关的神经退行性疾病进行生物活性和作用机理的研究。研究结果表明，人参多糖不仅能够延长秀丽线虫的寿命，而且还能抑制 polyQ 聚集并缓解与衰老相关的 polyQ 神经毒性，说明人参多糖可以通过延缓衰老，维护蛋白质平衡，起到神经保护作用。这些研究结果为抗衰老中药在治疗衰老相关的神经退行性疾病提供了理论参考。

[1] Alavez S,Vantipalli MC,Zucker DJ,et al.Amyloid-binding compounds maintain protein homeostasis during ageing and extend lifespan[J].Nature,2011,472(7342):226-229.

[2] Attele AS,WuJA,Yuan CS.Ginseng Pharmacology:multiple constituents and multiple actions[J].Biochem Pharmacol,1999,58(11): 1685-1693.

[3] Bauer PO,Wong HK,Oyama F,et al.Inhibition of rho kinases enhances the degradation of mutant huntingtin[J].Biol Chem,2009,284(19),13153-13164.

[4] Guo M,Wu TH,Song YX,et al.Reciprocal inhibition between sensory ASH and ASI neurons modulates nociception and avoidance in Caenorhabditis elegans.[J].Nat Commun,2015 (6):5655.

[5] Bence NF,Sampat RM,Kopito RR.Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation[J].Science,2001,292(5521):1552-1555.

[6] Bennett EJ,Shaler TA,Woodman B,et al.Global changes to the ubiquitin system in Huntington’s disease[J].Nature,2007,448(7154):704-708.

[7] Bercovich B,Stancovski I,Mayer A,et al.Ubiquitin-dependent degradation of certain protein substrates in vitro requires the molecular chaperone Hsc70[J].J Biol Chem,1997,272(14):9002-9010.

[8] Bergmann A.Autophagy and cell death:no longer at odds[J].Cell,2007,131(6):1032-1034.

[9] BI.Oxidative damage linked to neurodegenerationby -synuclein nitration in synucleinopathy lesions[J].Science,2000,290(11):985-989 .

[10] Ravikumar B,Vacher C,Berger Z,et al.Inhibition of mTOR induces autophagy and reduces toxicity of polyglutamine expansions in fly and mouse models of Huntington disease[J].Nat Genet,36(6):585-595.

[11] Zabel C,Nguyen HP, Hin SC,et al.Proteasome and oxidative phoshorylation changes may explain why aging is a risk factor for neurodegenerative disorders[J].J Proteomics,2010,73(11):2230-2238.

[12] Butterfield DA,Lauderback CM.Lipid peroxidation and protein oxidation in Alzheimer’s disease brain:potential causes and consequences involving amyloid β-peptide-associated free radical oxidative stress[J].Free Radic Biol Med,2002,32(11):1050-1060.

[13] Rubinsztein DC,Gestwicki JE,Murphy LO,et al.Potential therapeutic applications of autophagy[J].Nat Rev Drug Discov,2007,6(4):304-312.

[14] Douglas PM,Dillin A.Protein homeostasis and aging in neurodegeneration[J].J Cell Biol,2010,190(5):719-729.

[15] Douglas PM,Summers DW,Cyr DM.Molecular chaperones antagonize proteotoxicity by differentially modulating protein aggregation pathways[J].Prion,2009,3(3):51-58.

(编校：吴茜)

Effect of ginseng polysaccharides on polyQ accumulation toxicity and lifes pan ofCaenorhabditiselegans

CHEN Pei-lei1,PAN Jian-chun2Δ

(1.Department of Clinical Pharmacy, Yueqing Hospital Affiliated to Wenzhou Medical University, Yueqing 325600, China; 2.College of Pharmacy, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, China)

ObjectiveTo study the ginseng polysaccharides for prolonging the life span of theC.elegansand inhibit the toxic effects of polyQ accumulation.MethodsCaenorhabditis elegans of HA759 and AM141 were divided into control group and Ginseng group, seprately.Control group didn’t do any special treatment, Ginseng group were given 10 mg/mL polysaccharide and OP50-1 in the proportion of 1:4 mixed volume to 50 mL.C.elegansof glutamine (polyQ) polymer HA759 neurotoxicity model test of glutamine protein polymer toxicity experiment were done.The ASH neuron survival condition were tested.After sampling statistics gathered nematodes in the whole fluorescent points every day, study ginseng polysaccharide on polymers glutamine aggregation inhibition.Finally the solid life of twoC.elegans were studied.ResultsThe survival rate of ASH neurons inCaenorhabditiselegansHA759 of control group after 3 days culture was 53%.which of Ginseng group was 64% (P<0.05).The fluorescence of 48～96h aggregation points inCaenorhabditiselegansAM141 of control group were(6±1), (27±2), (56±4), which of Ginseng group were (4±1) in 48 h, (20±3) in 72 h and (45±2) in 96 h, the differences between two groups were all significant(P<0.05).The average survival time ofCaenorhabditiselegansAM141 of control group was (23±2)days, which of Ginseng group was (27±2)days; average survival time ofCaenorhabditiselegansHA759 of control group was (24±2)days, which of Ginseng group was (27±2)days,the difterences were all signiyicant(P<0.05).ConclusionGinseng polysaccharides can not only prolong the lifespan of theC.elegans, but also can restrain polyQ gathered and ease the polyQ neurotoxicity associated with aging.

ginseng polysaccharide;C.elegans;neurotoxicity;life span

陈佩雷，女，硕士在读，主管药师，研究方向：临床药学与药物分析，E-mail：C13868847229@163.com；潘建春，通讯作者，男，本科，教授，研究方向：神经药理学，E-mail：pjc13857750765@163.com。

R9

A

1005-1678(2015)03-0069-03