当归补血汤对吗啡戒断小鼠红细胞免疫功能的影响研究

顾鸿,田维毅,梅颖

(1.贵阳中医学院 实验针灸教研室，贵州 贵阳 550002；2.贵阳中医学院 免疫教研室，贵州 贵阳 550002；3.贵阳中医学院 中药教研室，贵州 贵阳 550002)



当归补血汤对吗啡戒断小鼠红细胞免疫功能的影响研究

顾鸿1,田维毅2,梅颖3

(1.贵阳中医学院 实验针灸教研室，贵州 贵阳 550002；2.贵阳中医学院 免疫教研室，贵州 贵阳 550002；3.贵阳中医学院 中药教研室，贵州 贵阳 550002)

目的 研究当归补血汤对吗啡戒断小鼠红细胞免疫功能的影响。方法 将50只实验小鼠随机分为5组：正常组、阳性对照组、药物高、中、低剂量组。后肢注射吗啡建立小鼠吗啡成瘾模型。红细胞计数仪测量5组小鼠的红细胞膜微粘度(erythrocyte membrane micro-viscosity，EM-MV)、红细胞变形指数(erythrocyte deformation index，EDI)；采用郭氏法测定红细胞免疫复合物花环率(red blood cell-immune complex rosette，RBC-ICR)、红细胞C3b受体花环率(red blood cell-C3b receptor rosette，RBC-C3bRR)；并观察5组红细胞免疫黏附促进因子(red blood cell regulator factor enhance rate，RFER)和红细胞免疫黏附抑制因子(red blood cell immune adherence inhibitor factor，RFIR)变化水平。结果 阳性对照组EM-MV均显著高于正常组、药物中剂量组和药物低剂量组(P<0.05)，阳性对照组EDI显著低于正常组、药物中剂量组和药物低剂量组(P<0.05)。药物中剂量组和低剂量组较阳性对照组明显RBC-ICR降低(P<0.05)，RBC-C3bRR显著高于阳性对照组(P<0.05)；药物中剂量组和低剂量组RFER水平显著高于阳性对照组，RFIR显著降低RFER(P<0.05)。结论 低剂量组和高剂量组当归补血汤提高吗啡戒断小鼠的红细胞免疫功能，改善戒断的症状，促进机体的快速康复，具有良好的临床应用价值。

当归补血汤；吗啡戒断；红细胞免疫

近年来，阿片药物的依赖和滥用已成为全球性问题，受到社会的广泛关注。现代医学研究发现[1]，当内源性阿片受体被脑啡肽、强啡肽等阿片类药物占据时，机体就会产生欣快感，这也是引起药物成瘾的生理学基础。由于阿片类依赖史细胞的一种适应反应，长期服用阿片类药物会提高中枢抑制的敏感性，正常服用药物会使敏感性处于潜伏状态。当断药时即表现出反跳性高兴奋状态，如竖尾、激惹等戒断症状。大量研究显示[1-2]药物滥用人群的细胞免疫、体液免疫和非特异性免疫功能均受到严重损害。基础研究显示[3-4]，红细胞免疫复合物花环率(red blood cell-immune complex rosette，RBC-ICR)会受到阿片类药物的毒性作用，导致细胞膜上脂质结构发生变化，降低红细胞膜的流动性，引起细胞膜上C3b受体数量降低，最终使机体的免疫功能下降。因此大量学者开始关注如何提高阿片类药物戒断后机体的免疫功能。当归补血汤源于李东桓的《内伤辨惑论》，全方由当归、黄芪组成，常用于治疗气血虚弱之证，是经典补血的方剂，它可以促进生血的物质形成，还能显著改善血液的生理功能，临床上已经广泛用于治疗免疫功能低下等疾病。本研究观察当归补血汤对吗啡戒断小鼠红细胞免疫功能的影响，以期为临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择50只昆明种小鼠，雌雄各半，体质量18～22 g(合格证号：scxk(黔)2002-0001)，由贵阳中医学院动物中心提供。本实验遵循《实验动物保护条例》。

1.2 药品与试剂 当归补血汤(自制，浓度为1.0 g/mL)，置于4 ℃冰箱中保存待用。盐酸吗啡(沈阳第一制药厂，国药准字H20013351)；盐酸纳洛酮(北京四环制药，H20055758)。

1.3 主要仪器 血细胞计数仪(成都贝斯达仪器有限公司)；高速离心机(江苏省金坛市环宇科学仪器厂)；生物显微镜(上海光学仪器厂，批号H20055758)。

1.4 小鼠吗啡依赖模型的建立 将各组小鼠笼中喂养4 d后，腹腔皮下注射盐酸吗啡，首日剂量10 mg/kg，第2天20 mg/kg，第3天40 mg/kg，第4天60 mg/kg，第5天80 mg/kg。最后1次注射吗啡后3 h，采用盐酸纳洛酮催瘾，若小鼠出现成瘾症状如竖尾、不停走动、流涎且达到戒断症状的评分标准，则认定造模成功。

1.5 实验分组 将50例小鼠随机分为5组：正常组、阳性对照组、药物高、中和低剂量组，每组10只。正常组：皮下注射与吗啡等量的生理盐水，每日1次，连续注射5 d，1周后股动脉取血0.5 mL。药物高剂量组：最后1次注射吗啡24 h后，灌胃给予当归补血汤20 mg/kg；连续给药7 d，1周后同正常组方法取血。药物中剂量组灌胃给予当归补血汤10 mg/kg，其余同药物高剂量组。药物低剂量组灌胃给予当归补血汤5 mg/kg，其余同药物高、中剂量组。阳性对照组：后肢注射盐酸吗啡，首日剂量10 mg/kg，第2天20 mg/kg，第3天40 mg/kg，第4天60 mg/kg，第5天80 mg/kg。最后1次注射吗啡后3 h，采用盐酸纳洛酮催瘾，1周后同正常组方法取血。将各组血样分装入离心管(1 mL/支)中，3500 r/min，离心10min后取上清液于-20 ℃冻存备用。

1.6 观察指标 ①采用荧光偏振法测定EM-MV，检测方法：取1.0 mg蛋白的红细胞膜，用1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(DPH)为荧光探针测定荧光强度(I)，当DPH进入膜脂层的中烃链区后期介质粘度显著增加，导致顺反式异构化转化受到抑制，当成为全反型时可以发出荧光。微粘度越小，红细胞膜流动性越大。采用激光衍射法测定TK；②采用郭氏法测定(RBC-CIC)、RBC-C3bRR，具体方法：取试管, 先加待测红细胞悬液500 μL，然后加补体致敏酵母菌悬液500 μL， 37 ℃水浴30 min，取出后轻轻摇匀,，涂片、固定、染色、计数、换算同RBC-C3b受体花环实验，其百分率作为红细胞膜上吸附免疫复合物量的指标。C3b实验：取1支小试管,先加待测红细胞悬液50 μL，然后加补体致敏酵母菌悬液50 μL，摇匀37 ℃ 水浴30 min，取出后轻轻摇匀，加生理盐水100 μL, 再加0. 25%戊二醛50 μL，再摇匀，取50 μL水平涂片。吹干后用姬姆萨-瑞氏染液染色1 min,，再加少许的瑞氏缓冲液染10 min，用自来水冲洗。最后在高倍显微镜下计数200个红细胞中的酵母菌的花环数，并换算成百分率，作为RBC-C3b受体活性的指标；③观察四组RFER(RFER)和RFIR(RFIR)变化水平。

2 结果

2.1 5组小鼠EM-MV和变形性对比 阳性对照组EM-MV均显著高于正常组、药物中剂量组和药物低剂量组(P<0.05)，说明药物依赖可以降低红细胞膜的流动性，低剂量组和高剂量组当归补血汤可有有效提高红细胞膜流动性。阳性对照组TK显著低于正常组、药物中剂量组和低剂量组(P<0.05)，说明药物依赖可以降低红细胞的变形性，低、中剂量当归补血汤可有效改善药物依赖引起的红细胞变形性降低；而高剂量当归补血汤对红细胞膜的流动性和变形性改善程度不明显，见表1、图1-5。

表1 5组小鼠EM-MV和TK比较Tab.1 Comparison of level of EM-MV andTK of five ±s)

△P<0.05，与阳性对照组相比，compared with positive control group

图1 各组红细胞变形情况1.正常组；2.阳性对照组；3.药物低剂量组；4.药物中剂量组；5药物高剂量组Fig.1 Changes in erythrocyte deformability of each group

2.2 5组RBC-ICR和RBC-C3bRR比较 阳性对照组小鼠RBC-ICR显著升高，与正常组相比有统计学意义(P<0.05)；药物中剂量组和低剂量组较阳性对照组显著降低(P<0.05)。阳性对照组RBC-C3bRR较正常组显著降低(P<0.05)，药物中剂量组和药物低剂量组与阳性对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)；而药物1组免疫复合物花环率和RBC-C3bRR与阳性对照组相比差异无统计学意义，见表2。

表2 5组小鼠RBC-ICR和RBC-C3bRR比较Tab.2 Comparison of level of RFER and RFIR of five ±s)

△P<0.05，与阳性对照组相比，compared with positive control group

2.3 5组小鼠RFER和RFIR变化水平比较 阳性对照组小鼠RFER明显降低，RFIR显著升高，与正常组相比，具有统计学意义(P<0.05)。阳性对照组相比，药物中剂量组和低剂量组RFER水平显著升高，RFIR显著降低(P<0.05)；药物高剂量组RFER和RFIR水平与阳性对照组差异无统计学意义，见表3。

表3 5组小鼠RFER和RFIR变化水平比较Tab.3 Comparison of level of RFER and RFIR of five ±s)

*P<0.05，与阳性对照组相比，compared with positive control group

3 讨论

目前已经证实[5]，红细胞是机体血液循环中的重要免疫细胞。红细胞不仅可以作为氧和二氧化碳的载体，还能特异性的识别、杀灭或清除血液循环中的免疫复合物。目前研究证实[6]，红细胞免疫在吗啡戒断后的免疫低下中起着重要的作用，其中最重要的是β内啡肽。β内啡肽对红细胞免疫功能起到双向调节作用，少量β内啡肽可以提高红细胞的免疫功能；当β内啡肽水平大量增加时，就会抑制红细胞免疫功能，且这种作用可以被纳洛酮阻断[7-8]。这说明β内啡肽是通过与细胞膜表面的阿片受体结合而起到免疫调节作用。

红细胞具有运载 O2和 CO2，维持能量代谢和内环境稳定的功能，又具有识别、黏附、杀伤抗原、清除血循环中的免疫复合物，免疫黏附细菌、病毒、肿瘤细胞及效应细胞，参与机体免疫调控，并有完整的自我调控系统。中医认为，气血是构成生命的基本物质。当气血不足时会引起机体免疫功能低下，通过补益气血可以有效提高机体对疾病的抵抗能力。本研究对吗啡戒断的小鼠给予当归补血汤，结果发现阳性对照组EM-MV均显著高于正常组、药物中剂量组和药物低剂量组(P<0.05)，说明药物依赖可以降低红细胞膜的流动性，低、中剂量当归补血汤可有效提高红细胞膜流动性。阳性对照组TK显著低于正常组、药物高剂量组和药物中剂量组(P<0.05)，说明药物依赖可以降低红细胞的变形性，低、中剂量当归补血汤可有效改善药物依赖引起的红细胞变形性降低；而高剂量当归补血汤对红细胞膜的流动性和变形性改善程度不明显。这证实合适剂量的当归补血汤可以有效改善红细胞的功能，对红细胞免疫功能有一定的促进作用，而随着剂量增大，这种促进作用增加的趋势并不明显。药物中剂量组和低剂量组较阳性对照组免疫复合物花环率显著降低(P<0.05)，C3b受体花环率显著高于阳性对照组(P<0.05)；药物中剂量组和低剂量组RFER水平显著高于阳性对照组，RFIR显著降低(P<0.05)，这证实了5 mg/kg和10 mg/kg当归补血汤可有效增强红细胞对免疫复合物的清除能力，改善红细胞的免疫功能。而当剂量继续增大至20 mg/kg时，上述指标改善程度并无提高趋势。

综上所述，低、中剂量当归补血汤提高吗啡戒断小鼠的红细胞免疫功能，改善戒断的症状，促进机体的快速康复，具有良好的临床应用价值。

[1] 李正红，于影，杨锐，等.内吗啡肽对小鼠树突状细胞免疫功能的影响[J].中国药理学通报，2011，27(7)：939-943.

[2] Malka S,Hawkins MG,Zabolotzky SM，et al.Immune-mediated pure red cell aplasia in a domestic ferret[J].J Am Vet Med Assoc,2010,237(6):695-700.

[3] Brine D,Le Tien HR,Crow A, et al.Transfusion of antibody-opsonized red blood cells results in a shift in the immune response from the red blood cell to the antibody in a murine model[J].Transfusion,2010,50(9):2016-2025.

[4] 杨鸿林，沈昊，范国红，等.高脂血症对红细胞天然免疫黏附功能变化影响的研究[J].临床军医杂志，2012，40(2)：360-362.

[5] Gupta RK,Ezeonyeji AN,Thomas AS, et al.A case of pure red cell aplasia and immune thrombocytopenia complicating systemic lupus erythematosus: response to rituximab and cyclophosphamide[J].Lupus,2011,20(14):1547-1550.

[6] 樊永平，宋丽君，叶明，等.二黄胶囊对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠中枢神经系统细胞因子和淋巴细胞亚群免疫组化表达的影响[J].中国实验方剂学杂志，2010，16(5)：142-146.

[7] 卢桂玲，李群燕.狼疮Ⅰ号方对SLE患者外周血T细胞免疫调节作用观察[J].中国中西医结合杂志，2011，31(11)：1573-1574.

[8] 方晓艳，苗明三.当归补血汤粗多糖补气生血作用研究和组方合理性探讨[J].时珍国医国药，2010，21(1)：93-94.

(编校：王冬梅)

Effect of Danggui Buxue Decoction on red cell immune function in mice with morphine abstinence syndrome

GU Hong1,TIAN Wei-yi2,MEI-Ying3

(1.Teaching and Research Section of Experimental Acupuncture, Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550002, China; 2. Teaching and Research Section of immunology, Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550002, China; 3. Department of Chinese Materia Medica, Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550002, China)

ObjectiveTo study the effect of Danggui Buxue Decoction on red cell immune function in mice with morphine abstinence syndrome.Methods50 mice were randomly divided into normal group,positive control group, high, medium, low dose group,Hindlimb injection of morphine in morphine dependent mice model was established. Erythrocyte membrane were measured in five groups of mice micro viscosity, erythrocyte deformation index; Determination of red cell immune complex rosette rate using the method (CIC), red cell C3b receptor rosette rate; and to observe the five group of regulator factor enhance rate (RFER) and immune adherence inhibitor factor (RFIR) levels.ResultsErythrocyte membrane microviscosity in model group were significantly higher than those in normal group, medium group and low group (P<0.05),red cell deformability index was lower than that of normal group, drug medium group and drug group low (P<0.05).Drug high group and medium group，immune complex rosette rate lower than in model group(P<0.05), C3b receptor rosette rate was significantly higher than that in the model group (P<0.05).ConclusionLow dose group and high dose group Danggui Buxue Decoction raises the red cell immune function in morphine withdrawal mice, improves the withdrawal symptoms, rapids rehabilitation of the body, has good clinical value.

Danggui Buxue Decoction;morphine withdrawal;red cell immun

贵州省科技厅攻关项目([2007]1039)

顾鸿，女，硕士，讲师，研究方向：中医针灸戒毒，E-mail：guhong1212@163.com。

R245.81

A

1005-1678(2015)03-0051-03