干细胞移植对缺血性二尖瓣关闭不全模型犬心肌组织SMA、bFGF、VEGF表达的影响

彭冉，李廷武

(河南省南阳医学高等专科学校第一附属医院 心脏外科，河南 南阳 473000)



干细胞移植对缺血性二尖瓣关闭不全模型犬心肌组织SMA、bFGF、VEGF表达的影响

彭冉，李廷武

(河南省南阳医学高等专科学校第一附属医院 心脏外科，河南 南阳 473000)

目的 探讨干细胞移植对缺血性二尖瓣关闭不全模型犬心肌组织中平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin，SMA)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表达的影响。方法 24只健康的雄性实验犬，随机选取6只为正常组，余18只建立二尖瓣关闭不全模型，模型成功后分为模型组5只、实验组6只和对照组6只。实验组向缺血心肌灌注2 mL干细胞悬液，对照组灌注等量不含干细胞的DMEM培养基。检测各组犬的心功能、心肌组织SMA、bFGF、VEGF表达水平并进行分析。结果 与对照组及模型组相比较，实验组心功能改善更为明显，表现为心输出量(cardiac output，CO)以及每搏输出量(stroke volume，SV)显著升高(P<0.05)；心肌组织α-SMA含量明显降低(P<0.05)；心肌组织bFGF含量明显升高(P<0.05)；心肌组织VEGF含量明显升高(P<0.05)。结论 干细胞移植能够抑制缺血性二尖瓣关闭不全模型犬心肌组织中SMA表达，促进bFGF和VEGF表达，对心功能有改善作用。

干细胞移植；缺血性二尖瓣关闭不全；平滑肌肌动蛋白；碱性成纤维细胞生长因子；血管内皮生长因子

缺血性二尖瓣关闭不全(mitral regurgitation，MR)是由于冠状动脉硬化闭塞导致局部心肌缺血坏死，乳头肌纤维化，弹性降低，左心室室壁运动异常而引起的，常继发于冠心病、心肌梗死之后，缺血性二尖瓣关闭不全形成的病理生理机制较为复杂，与心室大小、形态、局部心肌/乳头肌运动不协调、乳头肌延长或断裂等多种因素有关[1]。随着社会老年龄化的加重，二尖瓣关闭不全(MR)的发病率逐渐上升。有报道显示，65岁和75岁人群的MR发病率分别为6.4%和9.3%[2]，严重威胁人们生命健康。目前MR的主要治疗方式是外科手术[3]，但是由于适应症少、死亡率高、术后易复发等原因，临床效果并不理想，因此探索新的治疗方式是医学界研究的重点。干细胞移植是随着细胞技术的不断成熟出现的治疗手段，研究显示[4]，体外诱导可向心肌样细胞分化使人们看到了修复和再生受损心肌细胞的希望。干细胞可以被诱导分化成心肌细胞，修复受损的心肌组织，还能够释放相关细胞因子，抑制移植炎症反应，促进血管形成，对于缺血性心肌病有疗效。但是，关于干细胞移植治疗MR的研究较少。因此，本研究旨在通过建立缺血性二尖瓣关闭不全犬模型，观察干细胞移植对于其心功能、心肌组织中SMA、bFGF、VEGF的表达水平，研究干细胞移植对缺血性二尖瓣关闭不全的治疗效果及作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 24只健康雄性实验犬[由郑州大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(豫)2005-0001]，犬龄(8.2±1.6)月，体质量(10.6±1.4)kg。犬均投喂以标准饲料，自由进食，室温控制在15 ℃～24 ℃，湿度控制在55%～60%。

1.2 主要试剂和仪器 注射用硫喷妥钠(上海新亚药业有限公司，国药准字H31021847)；DMEM培养基、蛋白裂解液、10%胎牛血清(北京诺亚杰生物科技有限公司)；犬血管内皮生长因子(VEGF)、犬碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、犬α平滑肌肌动蛋白(α-SMA) ELISA检测试剂盒(上海彩佑实业有限公司)；WA-820数字无创心功能检测仪(天津万安康泰医疗科技有限公司)。

1.3 造模及实验方法 随机选取6只犬作为正常组，给予正常喂养；剩余18只犬，采用硫喷妥钠进行全身麻醉，开胸，对左冠状动脉前降支夹闭5 min，之后开放5 min，再关闭5 min，反复进行3次后将前降支结扎，闭合伤口。继续正常饲养8周，通过超声心动扫描仪观察犬的心脏结构，发现二尖瓣中重度返流即为造模成功[5]，本实验仅1只犬在实验过程中死亡，其余17只均造模成功。

在造模过程中，无菌条件下抽取实验犬的骨髓液10 mL，离心，弃上清，在沉淀的骨髓细胞中加入2 mL DMEM培养基，加入分离液，离心后将细胞接种在含10%胎牛血清的培养基上进行传代、培养，并用10 μmol/L的5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记。

将造模成功的17只犬分为模型组5只、对照组6只和实验组6只。模型组不予处置，对照组和实验组实验犬全身麻醉，暴露心脏，从左冠状动脉前降支结扎点进针，实验组向缺血心肌灌注2 mL干细胞悬液，对照组灌注等量不含干细胞的DMEM培养基悬液，观察30 min后，逐层关闭伤口。术后给予各组实验犬必要的抗感染措施，继续饲养8周。

1.4 观察指标及检测方法

1.4.1 心功能测定：移植完成8周后，采用心功能检测仪测定各组实验犬的心功能，包括心输出量(CO)及每搏输出量(SV)。

1.4.2 组织相关指标检测：全身麻醉后大动脉放血处死实验犬，取心肌组织，将组织标本剪碎，加入裂解液，放入匀浆器中进行反复匀浆，裂解30 min，随后将匀浆液移入离心管，4 ℃12000 r/min离心5 min，取上清液，置于-20 ℃保存备用。采用犬VEGF、bFGF、α-SMA ELISA检测试剂盒(购于武汉博士的生物技术有限公司)测定各组犬组织中VEGF、bFGF、α-SMA的表达情况。

2 结果

2.1 各组犬心功能比较 模型组、实验组、对照组实验犬的CO、SV均明显低于正常组(P<0.05)；对照组的CO、SV与模型组比较差异无统计学意义；实验组犬的CO、SV明显高于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 各组心功能比较±s)Tab.1 Comparison of the cardiac function of each ±s)

*P<0.05，与正常组相比，compared with normal group；#P<0.05，与对照组相比，compared with control group

2.2 各组犬心肌组织中α-SMA、bFGF、VEGF含量比较 模型组、实验组、对照组犬心肌组织中α-SMA、bFGF、VEGF含量均明显高于正常组(P<0.05)；对照组犬心肌组织中α-SMA、bFGF、VEGF含量与模型组相比差异无统计学意义；实验组犬心肌组织中α-SMA、bFGF含量明显低于对照组(P<0.05)，VEGF含量明显高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 各组心肌组织中α-SMA、bFGF、VEGF含量比较Tab.2 Comparison of the content of α-SMA, bFGF and VEGF of each ±s)

*P<0.05，与正常组相比，compared with normal group；#P<0.05，与对照组相比，compared with control group

3 讨论

近年来，随着我国冠心病的发病率不断升高，缺血性心肌病作为冠心病的晚期阶段，发病人数逐年增多，严重影响患者的生活质量，给患者带来较大的痛苦。缺血性二尖瓣关闭不全(MR)是缺血性心肌病常见的类型，对于MR的治疗，目前临床上多采用瓣膜成形、瓣膜置换等外科手段，但由于缺血已经引起心肌坏死，容易复发，成功率并不高。因此，医学界试图寻找治疗方式来修复受损心肌细胞，以防止心肌组织纤维化及心室重塑。干细胞移植是最有前景的研究方向，其能够分化为心肌细胞，修复受损的心肌组织，还具有旁分泌作用，促进各类生长因子分泌，同时其免疫调节及抗炎作用也不容忽视[6]。有研究显示[7]，注射自体心脏干细胞能够使心肌梗死后心力衰竭患者的左心室射血分数增加，心室收缩功能提高，而且梗死面积亦相应减少。但是，关于骨髓干细胞对MR的作用及机制的研究较少，因此，本研究试图通过观察干细胞移植对MR模型犬的作用，来观察干细胞移植对MR的治疗效果和作用机制。

本研究结果发现，模型组、实验组、对照组实验犬的CO、SV 均明显低于正常组(P<0.05)，表明心肌梗死后二尖瓣关闭不全模型犬的心功能受损；实验组犬的CO、SV 明显高于对照组(P<0.05)，表明干细胞移植能够明显改善模型犬的心功能。王祥森[9]报道，给猪心肌梗死模型注射单个骨髓干细胞，3周后左室射血分数比原来高46%，血流速度也明显增加，与本研究的结果一致。

α-SMA来自于心肌成纤维细胞，具有连接外纤维黏连蛋白的作用，引起组织的成纤维化，资料显示，在正常心肌组织中，α-SMA表达较低，而在心肌受损时，分泌的细胞因子能够促进α-SMA的分泌与表达[10]，所以模型组犬心肌组织中α-SMA含量明显高于正常组。本研究结果显示，实验组犬心肌组织中α-SMA含量明显低于对照组[9]，提示干细胞移植能够抑制α-SMA的表达，阻止心肌纤维化过程，这可能与干细胞分化形成新的心肌细胞，修复受损组织，抑制细胞因子异常分泌有关。

bFGF是碱性成纤维生长因子，具有促进细胞分裂、趋化，以及促进微血管形成的作用，能够促进修复，心肌受损后，机体会通过提高bFGF的表达量进行修复。研究发现，bFGF在心肌梗死后的心肌中表达增强[11]，与本研究结果显示的模型组犬心肌组织中bFGF含量明显高于正常组相一致；通过干细胞移植后，实验组犬心肌组织中bFGF含量明显高于对照组(P<0.05)，提示干细胞移植能够进一步刺激bFGF的表达，促进心肌细胞增殖修复，恢复心肌组织功能。

VEGF能特异性作用于血管内皮，促进血管内皮细胞分裂、增殖，有助于新生血管形成。资料显示，与bFGF相似，心肌组织受损的缺血缺氧状态亦可上调VEGF的表达[12]，使得模型组犬心肌组织中VEGF含量明显高于正常组(P<0.05)；经过干细胞移植治疗，实验组犬心肌组织中VEGF含量明显高于对照组(P<0.05)，表明干细胞能够增强VEGF的表达，促进新生血管的形成，建立侧支循环，改善心肌梗死部位的缺血缺氧状态，滋养新生的心肌细胞，有助于心肌组织及心功能的恢复。

本实验通过对缺血性二尖瓣关闭不全犬模型的建立，以及干预后心功能、心肌组织中SMA、bFGF、VEGF表达的分析，证实了干细胞移植能够抑制缺血性二尖瓣关闭不全模型犬心肌组织中SMA表达，促进bFGF和VEGF表达，对心功能有改善作用。下一步将进行分子机制方面研究，进一步论证和分析本研究结论。

[1] 伯平，张健群，黄方炯，等.缺血性二尖瓣关闭不全的外科治疗[J].中华胸心血管外科杂志，2004，20(4)：216-218.

[2] 赵笑春.二尖瓣夹合术治疗瓣膜关闭不全[J].中华心脏与心律电子杂志，2014(3)：45.

[3] 胡盛寿，张怀军，吴清玉，等.冠心病合并二尖瓣关闭不全的外科治疗[J].中华胸心血管外科杂志，2002，18(2)：69-71.

[4] 秦佳佳，冼绍祥，黄习文，等.体外诱导间充质干细胞向心肌样细胞分化的研究：药物、微环境及方法[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15(1)：139-142.

[5] 张浒，陶杰，白向锋，等.二尖瓣狭窄动物模型的建立[J].昆明医科大学学报，2015，36(2)：1-3.

[6] 卫洪超，朱洪生，崔世涛，等.干细胞移植对犬缺血性二尖瓣关闭不全影响的研究[J].中国现代医学杂志，2003，13(15)：34-36.

[7] 尹作民，李长江，王燕，等.冠状动脉内注射自体骨髓干细胞改善急性心肌梗死患者的心功能[J].中国医药，2010，5(9)：785-787.

[8] 曾建平.骨髓干细胞移植改善猪急性心梗后左室重构及相关机制的研究[D].长沙：中南大学，2008.

[9] 王祥森.抵当芪桂汤对糖尿病大鼠心肌组织中CTGF、α-SMA表达影响的实验研究[D].西安：陕西中医学院，2011.

[10] 杨靖，毛晓波，曾秋棠.急性心肌梗死后血管内皮细胞生长因子及碱性成纤维细胞生长因子表达动态变化[J].中国介入心脏病学杂志，2005，13(2)：114-116.

[11] 李志刚.HIF1α和VEGF在大鼠急性心肌缺血中的表达规律[D].广州：中山大学，2006.

(编校：谭玲)

Effect of stem cell transplantation on expression of SMA, bFGF and VEGF in myocardium of dogs with ischemic mitral regurgitation

PENG Ran, LI Ting-wu

(Department of Cardiac Surgery, The First Affiliated Hospital of Nanyang Medical College, Nanyang 473000, China)

ObjectiveTo analyze effect of stem cell transplantation on the expression of smooth muscle actin (SMA), basic fibroblast growth factor (bFGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in the myocardium of dogs with ischemic mitral regurgitation.Methods24 healthy male experiment dogs were selected, 6 were collected randondy as normal group, the others were used to construct mitral regurgitation model. After that, the modelized dogs were divided into three groups, 5 dogs in model group, 6 dogs in experiment group and 6 in control group. The experimental group were given 2 mL stem cells suspension to ischemic myocardial, control group was infused without stem cells in DMEM medium, and then the SMA, bFGF and VEGF expression levels of myocardial tissues in each groups were detected and analyzed.ResultsCompared with control group and model group, the heart function of experiment group were improved more obviously, such as cardiac output (CO) and stroke volume (SV) increased significantly (P< 0.05). Myocardial α-SMA were significantly lower (P<0.05). bFGF contents in myocardial tissue increased significantly (P< 0.05). The content of VEGF in myocardial tissue significantly increased (P<0.05).ConclusionsStem cell transplantation can inhibit the expression of SMA in myocardium of ischemic mitral regurgitation, and promote the expression of bFGF and VEGF, has a better effect on heart function.

stem cell transplantation; ischemic mitral regurgitation; smooth muscle actin; basic fibroblast growth factor; vascular endothelial growth factor

彭冉，男，主治医师, 研究方向：心脏外科及重症监护，E-mail：pengjiazidi@163.com。

R542.51

A

1005-1678(2015)08-0055-03