广西扶绥地区乙型肝炎病毒基因型分布的概况

李召发邓伟黄天壬李曦亮郑丹

作者单位：530021南宁1广西肿瘤防治研究所实验研究部；2广西医科大学研究生学院

流行病学调查

广西扶绥地区乙型肝炎病毒基因型分布的概况

李召发1，2邓伟1黄天壬1李曦亮1，2郑丹1，2

作者单位：530021南宁1广西肿瘤防治研究所实验研究部；2广西医科大学研究生学院

目的研究广西扶绥地区乙型肝炎（简称乙肝）患者H月V基因型分布特点，为本地区乙肝的防治及临床抗乙肝感染的治疗提供依据。方法采用巢式PCR技术对285例（肝癌40例，乙肝病毒携带者245例）扩增H月V S区基因，经测序后与标准序列比对，得出相应的基因型，分析H月V基因型的分布概况及其特点。结果在285例患者中，月基因型59例（20.7%），C基因型223例（78.2%），未分型3例（1.1%）。在肝癌和乙肝病毒携带者中，月基因型、C基因型分别为10例（25.00%）、30例（75.00%）和49例（20.25%）、193例（79.75%）（P＞0.05）；男性月基因型、C基因型分别为40例、158例，女性月基因型、C基因型分别为19例、65例，H月V基因型在男性和女性间的分布差异均无统计学意义（P均＞0.05）；在＜30岁、30～40岁、40～55岁、＞55岁各年龄组间H月V基因型的分布差异均无统计学意义（P均＞0.05）。结论扶绥地区H月V基因型以C基因型占主要优势，其次是月基因型，未见其他分型；H月V基因型在年龄、性别间的分布无明显差异。

肝肿瘤；乙型肝炎病毒；基因型；分布

乙型肝炎病毒基因型和基因亚型的分布具有明显的地域和人种差异，以往研究表明，我国乙型肝炎（简称乙肝）主要以H月V月基因型和C基因型感染为主，其基因亚型也呈现一定的地域分布。广西是乙肝高发地区，目前发病状况仍未得到有效控制。对广西扶绥地区乙肝病毒基因型的分布尚无文献报道。H月V基因型可能与病毒感染途径、基因突变、疾病进程和抗病毒疗效有一定关系，故研究基因型的分布情况及其特点，可为肝癌高发区H月V感染提供有益资料以及为H月V相关肝癌的病因学研究提供依据。本实验研究广西扶绥地区乙肝病毒基因型的分布概况及其特点。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源

对广西扶绥地区肝癌高危人群进行调查研究，通过血清采集及处理，最终筛选285例研究对象（H月V DNA病毒拷贝数≥103），其中肝癌患者40例，临床无症状的乙肝病毒携带者245例。肝癌病例的诊断符合2001年中国抗癌协会肝癌专业委员会修订的《原发性肝癌的临床诊断与分期标准》，乙肝病毒携带者为乙型肝炎病毒表面抗原阳性者。研究对象的血清经分离后置-80℃冰箱保存备用。

1.2 血清H月V DNA复制水平的检测

采用PCR-荧光探针法（乙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒为湖南圣湘生物科技有限公司产品）检测H月V DNA复制水平，检测步骤参照试剂说明书，将50 ml血清样本与5μl核酸释放剂充分混匀后作为PCR反应的模板，加入40μl PCR-mix，2 000 r/min离心30 s，最后进行PCR扩增。检测下限值为500拷贝/ml。

1.3 H月V DNA的提取和扩增

从患者血清中提取DNA（北京天根PD315试剂盒），操作步骤按照说明书进行，取研究对象血清200μl H月V DNA，溶解于30μl ddH2O中。采用巢式PCR扩增H月V S区基因。第一轮扩增引物为Fgp1和Rgp2，第二轮扩增引物为Fgp3和Rgp4。S区PCR第一轮反应条件为95℃2 min；95℃35 s，58℃30 s，72℃60 s，30个循环；72℃10 min。第二轮反应条件为95℃2 min；95℃35 s，60℃30 s，72℃60 s，30个循环；72℃10min。引物序列见表1。

表1 HBV S区的巢式PCR扩增引物

1.4 基因测序及基因型分析

所有PCR产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，交由北京六合华大基因科技股份有限公司广州分公司进行测序，并经A月I3730xl基因分析仪进行双向测序。对返回的测序结果用Chromas Pro 1.21软件进行分析，序列比对用DNAMAN 7.0。测序后得到的前S基因序列，采用NC月I的在线病毒基因分型工具确定H月V基因型。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行分析。计数资料采用百分率表示，各组资料间两两比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 H月V基因型的分型

285例患者H月V基因型分型中，月基因型59例（20.7%），C基因型223例（78.2%），未分型3例（1.1%）。提示扶绥地区C基因型较月基因型的分布占优势。

2.2 H月V基因型在肝癌及乙肝病毒携带者之间的分布

在40例肝癌患者中，月基因型10例（25.00%），C基因型30例（75.00%）；在乙肝病毒携带者中，月基因型49例（20.25%），C基因型193例（79.75%）。提示在肝癌和乙肝病毒携带者中，C基因型较月基因型占优势，但两组H月V基因型的分布差异无统计学意义（χ2=0.47，P＞0.05）。

2.3 H月V基因型在男性、女性间的分布

经统计分析，在男性、女性中月基因型和C基因型的分布分别为40例、158例和19例、65例，二者比较差异均无统计学意义（P均＞0.05）。即H月V基因型在男性、女性间的分布未见明显差异。

2.4 H月V基因型在各年龄组间的分布

经统计分析，月基因型者平均年龄51岁，C基因型者平均年龄49岁。在各年龄组间H月V基因型的分布差异均无统计学意义（P均＞0.05）。见表2。

表2 HBV基因型在各年龄组间分布的比较［n（%）］

3 讨论

慢性乙型病毒性肝炎是严重危害人类身体健康的传染病，呈全球广泛分布。根据H月V全基因组序列差异程度，以8%的序列差异为分型标准。我国目前将H月V分为A～H 9种基因型，H月V基因型具有地域分布的特异性［1］。而不同基因型H月V的复制能力和逃逸宿主免疫压力的能力不同，从而导致不同地区H月V感染率和基因型分布呈一定的地理流行病学特征［2～4］，故对H月V基因型流行病学的研究具有重要意义。

H月V基因型的差异将导致H月V感染者临床表现、预后、抗病毒疗效的差异。有研究表明，这些疾病谱的不同除了与感染者年龄、机体免疫力、H月V DNA载量有关外，还与H月V基因型有关。研究表明，H月V基因型中在以月基因型、C基因型为主的亚洲地区，C基因型患者肝炎与肝纤维化程度较月基因型者严重，C基因型与严重的肝病有关，是慢性H月V感染向肝硬化、肝癌进展的危险因素［5～7］。本研究显示扶绥地区C基因型在所有H月V基因型中占优势，与上述研究结果相符。

免疫治疗是目前治疗肝癌的重要研究方向，已有多种治疗方法应用于临床，并取得了一定的疗效［8］。研究不同地区H月V基因型的分布及其特点，可为肝癌的免疫治疗提供分子水平的理论依据。

研究表明，中国北方H月V基因型以C基因型为主，南方则以月基因型为主［9］。月基因型患病年龄较小，而C基因型患病年龄较大。本研究结果显示，C基因型患病平均年龄较月基因型偏小，这可能与地区和种族差异以及样本量大小有关。本研究对广西扶绥地区乙肝病毒基因型分布情况及其在不同年龄、性别的差异进行分析，结果发现在广西扶绥地区285例患者中，H月V基因型中月基因型与C基因型的构成比分别为20.7%及78.2%，与前期文献［9］报道不符，分析认为可能与扶绥地区基因型分布的个性特征及样本来源、样本量大小等因素有关。因此必须通过多中心和扩大样本量进行更深入地研究，以进一步了解我国H月V基因型的分布概况，这对乙型肝炎的防治有重要意义。本研究显示，H月V基因型在男性、女性间及各年龄组间的分布均无明显差异，提示性别及年龄对广西扶绥地区H月V基因型的分布没有明显影响。加强H月V基因型的检测，了解本地区乙肝患者基因型的分布及其特点，将对乙型肝炎的防治及临床抗乙肝感染治疗提供可靠的实验依据。有关方面有待深入研究。

［1］Robertson BH，Margolis HS.Primate hepatitis B viruses-genetic diversity，geography and evolution［J］.Rev Med Virol，2002，12（3）：133-141.

［2］Pujol FH，Navas MC，Hainaut P，et al.Worldwide genetic diversity of HBV genotypes and risk of hepatocellular carcinoma［J］.Cancer Lett，2009，286（1）：80-88.

［3］Wilt TJ，Shamliyan T，Shaukat A，et al.Management of chronic hepatitis B［J］.Evid Rep Technol Assess（Full Rep），2008，（174）：666 -671.

［4］Mahtab MA，Rahman S，Khan M，et al.Hepatitis B virus genotypes：an overview［J］.Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2008，7（5）：457-464.

［5］赵鸿，李俊，李兴丰，等.感染乙型肝炎病毒不同基因型和亚型患者的临床特点分析［J］.中华流行病学杂志，2007，28（1）：74-77．

［6］Sumi H，Yokosuka O，Seki N，et al.Influence of hepatitis B virus genotypes on the progression of chronic type B liver disease［J］. Hepatology，2003，37（1）：19-26．

［7］Lee CM，Chen CH，Lu SN，et al.Prevalence and clinical implicationsof hepatitis B virus genotypes in southern Taiwan［J］.Scand JGastroenterol，2003，38（1）：95-101．

［8］唐耘天，唐步坚.原发性肝癌免疫治疗的研究进展［J］.中国癌症防治杂志，2013：5（1）：79-82.

［9］杨军，秦波.乙肝病毒基因型的研究进展［J］.西南国防医药，2011，21（3）：338-340.

［2015-01-03收稿］［2015-01-25修回］［编辑阮萃才］

Distribution of hepatitis B virus genotypes in the Fusui regional of Guangxi，China

LI Zhaofa1，2，DENG Wei1，HUANG Tianren1，LIXiliang1，2，ZHENG Dan1，2（1Research Department of Guangxi Cancer Institute，2Graduate School of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）

HUANG Tianren.E-mail：tianrenhuang@sina.com

ObjectiveTo study the genotype distribution of hepatitis月virus（H月V）in patients from the Fusuiarea of China in order to guide prevention and treatment efforts.M ethodsA total of 40 patientswith liver cancer and 245 H月V carrierswere analyzed using nested PCR to amplify the H月V S region.The amplicons were sequenced and analyzed in sequence alignments with published H月V genotypes.ResultOf the 285 participants，59（20.7%）were infected with genotype月virus，223（78.2%）with genotype C，and 3（1.1%）with an undefined genotype.Of the 282 participantswith either genotype月or C virus，men accounted for 40 with genotype月and 158 with genotype C；women accounted for 19 with genotype月and 65 with genotype C.The gender distribution was similar for these two genotypes（P＞0.05）.Among liver cancer patients，10（25%）had genotype月and 30（75%）had genotype C；among H月V carriers，49（20.25%）had genotype月and 193（79.75%）had genotype C.Stratification of patients into four age groups（＜30 years，30-40 years，40-55 years，and＞55 years），The distribution of these two genotypes was similar in the four age groups（P＞0.05）.ConclusionH月V genotype C predominates in the Fusui area，followed by genotype月，with no other types observed.Genotypes月and C are distributed similarly among individuals of different age and gender.

Liver neoplasm；Hepatitis月virus；Genotype；Distribution

R373.2+1

A

1674-5671（2015）02-03

10.3969/j.issn.1674-5671.2015.02.10

国家自然科学基金资助项目（30960333；81260319），广西高校科研基金资助项目（2013ZD016）

黄天壬。E-mail：tianrenhuang@sina.com