鸡源空肠弯曲菌调查与耐药性分析

孙桂霞，徐世文

（东北农业大学动物医学学院，哈尔滨150030）

鸡源空肠弯曲菌调查与耐药性分析

孙桂霞，徐世文*

（东北农业大学动物医学学院，哈尔滨150030）

空肠弯曲菌是严重危害人畜健康的病原菌，为了解哈尔滨市肉鸡源性空肠弯曲菌流行病学和耐药性，研究调查哈尔滨市周边肉鸡场空肠弯曲菌感染状况，通过耐药性和耐药基因检测，发现鸡场平均感染率为35.67%，对13种抗生素均有不同程度耐药性，四环素和氨苄西林钠达100%，存在多重耐药性，最高耐药谱达11个，检出菌株率为14.95%。57.94%菌株携带tetA、tetB、tetC、blaCTX-M、blaTEM和blaNDM-1基因，检出率分别为57.94%、66.36%、28.97%、42.99%、55.14%和8.41%，而tetD和blaSHV-1基因未检出。结果表明，哈尔滨市肉鸡场空肠弯曲菌感染普遍，存在多重耐药并携带多种耐药基因，为有效防治空肠弯曲菌病提供依据。

肉鸡；空肠弯曲菌；耐药性；耐药基因

空肠弯曲菌是常见的人兽共患病原菌。人类除引起肠炎外，还可引起中毒、肝炎、关节炎和格林-巴利综合症等免疫损伤性疾病[1-2]。兽医临床上常见症状是腹泻，此外也见于乳房炎、不孕、流产和禽类肝炎[3]。世界卫生组织已将该病列为最常见的食源性传染病之一，我国在上海、北京、福建等地多次报道经食物感染该菌引发的疾病[4]。动物产品是人感染空肠弯曲菌主要来源，鸡肉和鸡蛋是主要消费动物性食品。鸡是空肠弯曲菌病重要传染源，消费鸡肉与空肠弯曲菌的流行紧密相关[5]。开展肉鸡空肠弯曲菌流行病学调查，掌握其流行情况，采取相应方法预防尤为重要。本研究调查哈尔滨市5个大型鸡场肉鸡空肠弯曲菌感染情况，通过耐药性试验和耐药基因检测，为了解哈尔滨市不同鸡场空肠弯曲菌流行分布状况，阐明其流行规律、耐药性以及预测其流行趋势和有效防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 检测样本及来源

样本采自哈尔滨市5个肉鸡场，每个鸡场采集28、42日龄肉鸡各30份肛试子，共300份，样品采集后置于运送培养基中，于24 h内送达东北农业大学动物医学学院兽医内科实验室，并立即检测。

1.1.2 培养基和试剂

改良Camp-BAP培养基和改良布氏肉汤购自青岛海博有限责任公司；氨苄西林、哌拉西林、头孢他啶、头孢噻肟、厄他培南、美罗培南、阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、四环素、环丙沙星、替吉环素和多黏菌素，购自中国药品生物制品监督所；Taq DNA聚合酶（5 U·μL-1）、10×PCR buffer、25 mmol·L-1MgCl2、Dntp mixture（各2.5 mmol·L-1）、DNA Marker DL2000等购自宝生物工程（大连）有限公司，其他均为常规化学试剂。

1.2 方法

1.2.1 空肠弯曲菌分离培养与鉴定

空肠弯曲菌分离鉴定按GB/T 4789.9-2008标准进行[6]。

1.2.2 药敏试验

按照微生物药物敏感性试验执行标准检测[7]。

1.2.3 耐药基因检测

根据GenBank已发表耐药基因序列，参考张博试验设计[8]，对空肠弯曲菌进行8种耐药基因PCR检测，其中包括四环素类耐药基因（tetA、tetB、tetC和tetD）和β-内酰胺类耐药基因（blaSHV-1、blaCTX-M、blaTEM和blaNDM-1）。引物由上海生工合成，如表1所示。PCR体系取模板cDNA 2.0 μL，10 pmol·μL-1上下游引物各1 μL，混合Tag酶9.5 μL，加入灭菌双蒸水至25 μL。PCR反应条件为，95℃预变性5 min，94℃变性30 s，60℃30 s，72℃30 min，35个循环，72℃延伸10 min。取PCR反应产物5 μL，于3.0%琼脂糖凝胶中电泳，以检测扩增效果。

表1 扩增目的基因引物序列及目的片段长度Table 1Primer sequence and amplification length of destination fragment

2 结果与分析

2.1 肉鸡场空肠弯曲菌检出率

按照国标空肠弯曲菌检验（GB/T 4789.9-2008）方法[6]，通过对300份病料分离培养，共鉴定出阳性病料107份，阳性率为35.67%，但不同鸡场污染率不同，最高检出率为78.33%（47/60），最低检出率为8.33%（5/60）。

2.2 空肠弯曲菌耐药性检测结果

由表2可知，总耐药率最高为四环素（92.52%），最低为多粘菌素（5.61%）。但各鸡场耐药性差异较大，如E场对四环素、氨苄西林耐药率达100%，而D场对庆大霉素耐药率为100%。

由表3可知，分离出的空肠弯曲菌存在多重耐药性，在检测的13种抗生素药物中，最高耐药谱达到11个，检出菌株率为14.95%。多粘菌素具有较高敏感性。

2.3 耐药基因的检测结果

由表4可知，分离出的空肠弯曲菌中有57.94%携带tetA基因，携带tetB基因为66.36%，携带blaNDM-1基因检出最低，为8.41%。而tetD和blaSHV-1基因未检出。

表2 空肠弯曲菌分离株耐药率分析结果Table 2Results about the resistant rate of Campylobacter jejuni separate strains

表3 空肠弯曲菌耐药谱分析结果Table 3Antibiogram results of Campylobacter jejuni

表4 耐药基因阳性菌株数量及检出率Table 4Number and detection rate of positive strains resistant genes

3 讨论与结论

3.1 鸡源空肠弯曲菌流行病学调查结果分析

空肠弯曲菌是多种动物空肠中多见条件性致病菌，该菌在肠道内大量繁殖，通过粪便排到体外，污染食物、水源，常可引起人类感染。流行病学调查显示，鸡具有很高的带菌率，不同地区带菌率存在明显差异。广东地区鸡、鸭和鹅空肠弯曲菌带菌率分别为7.93%、2.46%和4.16%[9]。贵阳市鸡、猪空肠弯曲菌带菌率分别为17.33%、12.0%[10]。调查结果显示，哈尔滨市5个肉鸡场中空肠弯曲菌检出率平均为35.67%，最高检出率为78.33%（47/ 60），最低检出率为8.33%，远高于河南0.6%、江苏7.6%、华东地区8.96%、山东30.8%的分离率，低于上海43.2%、安徽45.2%、浙江30.4%等地的分出率[11-15]。研究表明，鸡群携带空肠弯曲菌最高可达100%[16]。

3.2 鸡源空肠弯曲菌耐药性分析

四环素类和β内酰胺类药物是兽医临床上常用的抗生素，随该药物大量使用，细菌耐药问题严重，已引起关注。Reina和Bardon研究证实，空肠弯曲菌对壮观霉素、庆大霉素耐药性为1.0%～9.4%[17-18]，Luangtongkum等研究表明，空肠弯曲菌对红霉素耐药率为80%[19]，Jain等报道，空肠弯曲菌对四环素耐药率仅为26.5%[20]。韩新锋等对成都市及雅安市肉鸡生产链调查表明，空肠弯曲菌分离株对环丙沙星、左氟沙星、四环素和克林霉素耐药率较高，分别为94.44%、93.89%、91.67%和78.33%，对红霉素（20.00%）、链霉素（20.56%）、庆大霉素（17.78%）、氟苯尼考（12.22%）呈现不同耐药率[21]。本试验调查显示，分离空肠弯曲菌株对四环素耐药率最高（92.52%），其次为环丙沙星（84.11%），再次为氨苄西林耐药率为80.37%。这与国内报道不完全一致[22-23]。同时，本研究还发现，空肠弯曲菌存在多重耐药谱，与多数报道一致[24]，表明临床上存在抗生素滥用。

台湾、泰国和西班牙的研究资料显示，空肠弯曲菌氟喹诺酮抗性比率分别是56.9%、84%和75%～88%[25-27]。耐药基因检测发现，分离株空肠弯曲菌普遍携带耐药基因。Andersen等调查丹麦空肠弯曲菌耐药性，研究结果表明，弯曲杆菌携带多种耐药基因，如tetA、tetB、blaCTX-M和blaTEM等[28]。姜毅等研究发现，对环丙沙星耐药的15株空肠弯曲菌均检测出在gyrA基因257位发生点突变[24]。Kurincic等证实CmeABC外排泵在弯曲杆菌固有红霉素耐药性和获得低水平红霉素耐药性中的作用[29]。Ge等证实，cmeB失活可影响空肠弯曲菌对氯霉素、环丙沙星、红霉素和四环素的敏感性[30]。空肠弯曲菌分离菌群对喹诺酮类有更高的耐药水平，其有两个突变，一个在gyr的Th-r86上，另外在拓扑异构酶IV残基的Arg-139上[31]。本研究发现，分离株空肠弯曲菌耐药基因携带率较高，tetB为66.36%，tetA为57.94%，blaTEM为55.14%，blaCTX-M为42.99%，表明所调查鸡场感染的空肠弯曲菌普遍携带耐药基因，结论可为鸡场防治空肠弯曲菌病、有效消除耐药性和耐药基因传播提供理论依据。

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Investigation and resistance analysis ofCampylobacter jejuniin broiler/

SUN Guixia,XU Shiwen
(School of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Campylobacter jejuniis a kind of pathogenic bacteria which cause serious damage to the human and animal health.To understand the epidemiological and drug resistance ofCampylobacter jejuniin broiler of Harbin,the present study investigated the infection status ofCampylobacter jejuniin broiler in Harbin and its surrounding area,meanwhile,detected the drug resistance and expression of resistant genes. The results showed that the average infections of chicken farms were 35.67%.Campylobacter jejunihad different degrees of antibiotic resistance to 13 kinds of antibiotics,which the antibiotic resistance of tetracycline and ampicillin sodium were 100%,while there were multiple drug resistance.The highest drug-resistant spectrums were 11,while the detection rate of bacterial strain was 14.95%.57.94%bacterial strain containedtetA,tetB,tetC,blaCTX-M,blaTEMandblaNDM-1 genes,that the detection rate were 57.94%,66.36%,28.97%,42.99%,55.14%and 8.41%,respectively.However,the present study didn't detecttetDandblaSHV-1 genes.The results showed that the infections ofCampylobacter jejuniin chicken farms of Harbin were occured commonly,while there were multiple drug resistance.It provided the basis for effective prevention and treatment ofCampylobacter jejuni.

broiler;Campylobacter jejuni;drug resistance;resistance genes

S831

A

1005-9369（2015）09-0064-05

时间2015-9-23 9：38：10[URL]http：//www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150923.0938.012.html

孙桂霞,徐世文.鸡源空肠弯曲菌调查与耐药性分析[J].东北农业大学学报,2015,46(9):64-68.

Sun Guixia,Xu Shiwen.Investigation and resistance analysis ofCampylobacter jejuniin broiler[J].Journal of Northeast Agricultural University,2015,46(9):64-68.(in Chinese with English abstract)

2015-04-07

环保部公益性项目(200909043)

孙桂霞（1966-），女，兽医师，博士研究生，研究方向为畜产品安全。E-mail：746930375@qq.com

*通讯作者：徐世文，教授，博士生导师，研究方向为畜禽营养代谢病与中毒病。E-mail：shiwenxu@neau.edu.cn