龙眼体细胞胚胎发生过程中DlWUS 的克隆与表达分析

张冬敏，田奇琳，杨曼曼，林玉玲，赖钟雄

（福建农林大学 园艺植物生物工程研究所，福州350002）

体细胞胚胎发生是植物体外再生的一种有效方法，目前已经有许多经济作物利用体细胞胚胎发生来获得体外再生植株，并且因为体细胞胚胎发生的生长发育过程类似于合子胚，所以也常常作为研究高等植物合子胚生长发育的模式材料。外植体诱导体细胞胚胎发生无论是直接从胚性细胞诱导还是经愈伤组织形成的胚性愈伤组织最后形成，都需经过一个胚性细胞阶段［1］。早年的研究多集中于外源激素对植物体细胞胚胎发生的影响，近年越来越多与体细胞胚胎发生相关的基因被鉴定出来，其中包括编码同源异型结构域蛋白新亚基的转录因子WUSCHEL（简称WUS）。WUS 是WUS HOMEO－BOX（WOX）家族成员，具有典型的HOX、WUS box 和EAR－like位点［2－5］。主要在茎端分生组织的干细胞组织中心和花分生组织中表达，被认为是决定干细胞命运的基因。在干细胞形成前开始表达，诱导周围细胞形成并维持干细胞特性，加速周边干细胞的分裂速度，与CLAVATA3（CLV3）形成一个负反馈调节环，共同维护分生组织中干细胞团数量的稳定，促进体细胞胚胎的形成［6－7］。

WUS 的表达可以诱导植物的体细胞向胚性细胞转变，进而提高植物体细胞胚胎发生能力［8－9］。一般认为，植物体细胞胚胎发生是由于外源施加的生长素促发信号级联反应进而诱导体细胞胚胎发生，因此植物体细胞胚胎发生需依赖于较高浓度的外源生长素，而研究发现WUS 的超表达可使拟南芥（Arabidopsis）体细胞在无外源激素诱导下形成体细 胞胚［10］。Zheng 等［11］将 拟 南 芥AtWUS 转 入 陆地棉中，异位表达的AtWUS 使得陆地棉（Gossypium hirsutum）CRI12 品种的愈伤分化率从原先的0．61%上升到47．75%，可见WUS 转录因子参与调控植物体细胞胚胎的形成。

虽然植物体细胞胚胎发生是植物体外再生的有效方法，但存在体细胞胚诱导率及转换率的问题，目前还有许多植物较难诱导体细胞胚胎发生，如拟南芥以及一些多年生木本植物。因为WUS 转录因子在体细胞胚胎发生过程中发挥了重要作用，所以研究其在植物体细胞胚胎发生过程中的表达规律对改善难体胚发生植物的体胚发生能力意义深远。龙眼（Dimocarpus longan Lour．）作为重要的南方经济果树，是较早建立体胚高频再生系统的木本植物，早在1997年赖钟雄等［12－13］就利用龙眼‘红核子’LC2悬浮细胞系诱导的胚性愈伤组织诱导并建立龙眼体细胞胚胎发生系统，之后由陈春玲等［14］进一步研究，目前已经可以同步化培养获得龙眼不同发育阶段的体细胞胚胎。因此，本研究以现有的龙眼体细胞胚胎发生系统为材料，分离和克隆龙眼WUS 基因，并通过实时荧光定量PCR 研究其在龙眼体细胞胚胎发生过程中的表达规律以及外源激素处理对其表达的影响，期望为解决多年生木本植物体细胞胚胎发生困难的问题提供解决方向。

1 材料和方法

1．1 供试材料

以赖钟雄等［13］建立的龙眼‘红核子’LC2悬浮细胞系诱导并由福建农林大学植物工程研究所继代保存的胚性愈伤组织为试验材料。按照龙眼体细胞胚胎发生同步化调控的方法［14－15］诱导获得龙眼不同体细胞胚胎发生阶段的材料，包括：球形胚、不完全胚性紧实结构、心形胚、鱼雷形胚和子叶胚，以及不同激素处理的龙眼胚性愈伤组织用于实时荧光定量PCR 材料。激素处理参照曾丽兰［16］的方法，取继代培养20d、生长良好的龙眼胚性愈伤组织，分别接种于添加吲哚乙酸IAA（0．0、0．5、1．0和1．5mg／L）、赤霉素GA3（0．0、3．0、6．0、10．0、12．0 和25．0 mg／L）及 水 杨 酸SA（0．0、50．0、75．0 和100．0 μmol／L）的MS液体培养基中，25 ℃，150r／min震荡培养24h。

1．2 方 法

1．2．1 DlWUS 基因克隆 采用TriPure Isolation Reagent（Roche）提取龙眼各个体细胞胚胎发生阶段（胚性愈伤组织、球形胚、鱼雷形胚和子叶胚）混合材料的总RNA，具体步骤参见试剂说明书；按照GeneRacer Kit（Invitrogen）的使用说明逆转录合成cDNA 第一链，用于DlWUS 基因cDNA 序列的扩增。龙眼胚性愈伤组织DNA 的提取参照王凤华等［17］的方法。

采用同源克隆与RACE 法，以GeneRacer Kit（Invitrogen）逆转录合成的龙眼混合体胚材料cDNA第一链为模板，根据NCBI上已登录的其他植物WUS 基因的核苷酸序列，在其保守区域设计引物WUS－F1和WUS－R1，进行保守区的扩增，利用获得的保守区序列设计3′－RACE 引物对WUS－3P和WUS－3NP，5′－RACE 引物对WUS－5P 和WUS－5NP，分别进行巢式PCR，扩增DlWUS 的3′和5′端序列；依据拼接获得的DlWUS 全长序列，在该序列的5′和3′端分别设计引物WUS－F2和WUS－R2，进行该基因序列的全长cDNA 扩增，同时以龙眼胚性愈伤组织DNA 为模板，全长cDNA 扩增引物进行PCR 反应，获得龙眼WUS 的DNA 序列，引物具体信息列于表1。反应程序：94℃预变性3min，94℃变性30s，退火30s（退火温度见表1），72 ℃延伸按1kb／min设置，共35个循环，72 ℃终延伸10min。

表1 DlWUS基因克隆与表达分析引物信息Table 1 Primers used in DlWUSgene cloning and Real－time quantitative PCR

1．2．2 龙眼WUS 基因的生物信息学分析 以DNAMAN 6．0对扩增获得的序列进行拼接；利用ORF Finder在线软件寻找序列开放阅读框并推导编码的氨基酸序列；采用ExPASy Protpara在线软件分析DlWUS 编码的氨基酸序列的理化性质；利用SignalP 4．1Server预测DlWUS 编码蛋白质的信号肽；采用WoLF PSORT 在线软件预测DlWUS的亚细胞定位情况；使用TMpred Server预测Dl－WUS 的跨膜区；用NetPhos 2．0Server预测Dl－WUS 基因翻译后修饰的磷酸化位点；采用NCBI Blastp 预测DlWUS 的保守结构域；利用COILS Server预测DlWUS 形成的卷曲螺旋的倾向性；利用SOPMA 在线软件预测DlWUS 的二级结构；利用MEGA 5．2软件的Neighbor－Joining（邻位相接法，NJ 法）进行WUS 的系统进化树构建，并用Bootstrap法（重复1 000次）对构建的进化树进行评估。

1．2．3 DlWUS 基因的实时荧光定量PCR 分析 胚性愈伤组织、不完全胚性紧实结构、球形胚、心形胚、鱼雷形胚、子叶胚及经激素处理的胚性愈伤组织的总RNA 的提取方法同1．2．1；采用SYBR Ex－ScriptTM试剂盒（TAKARA 公司）反转录合成cDNA 第一链，用于DlWUS 基因的荧光定量分析，具体步骤参见试剂盒使用说明。以EIF－4a、EF－1a 和FSD 基因作为内参基因，以引物WUS－qF、WUSqR（表1）进行实时荧光定量PCR，采用三步法，将不同发育阶段的龙眼体胚cDNA 模板混样进行5倍梯度系列稀释制作标曲，处理样品cDNA 模板稀释15倍后进行荧光定量PCR，3次重复，具体的反应体系及扩增程序参照Lin等［18］。最终获得的数据 利 用 公 式2－Δα及Excel、geNORM（version 3．5）［19］软件进行分析。

2 结果与分析

2．1 DlWUS 基因cDNA全长与DNA序列的克隆

以合成的龙眼混合样的全长cDNA 第一链为模板，以引物WUS－F1／WUS－R1进行PCR 扩增获得了预期的136bp保守序列；以引物WUS－3P／3P，WUS－3NP／3NP进行巢式PCR，扩增获得774bp 3′端序列，包括150bp 3′－UTR（含poly A）；以引物WUS－5P／5P，WUS－5NP／5NP 进行巢式PCR，扩增获得253bp的5′端序列，包括102bp的5′－UTR。利用DNAMAN 6．0将获得的3段序列进行拼接，龙眼WUS 基因cDNA 序列全长1 110bp，经NCBI的GenBank数据库在线Blastn，结果显示与其他物种的WUS 基因一致性较高，初步推断扩增得到的三段序列为龙眼WUS 基因的序列。以设计的全长扩增引物WUS－F2和WUS－R2进行PCR 扩增，获得867bp的目的序列，与拼接结果相同，均包含完整的开放阅读框；将该转录本的核苷酸序列在NCBI的GenBank数据库中进行在线Blastn分析，结果显示该序列与其他物种的WUS 基因同源性较高，其中与脐橙（Citrus sinensis，EU032533）、蓖麻（Ricinus communis，XM002530689）和 葡 萄（Vitis vinifera，XM002266287）的一致性分别为70%、70%和83%，由此认为扩增得到龙眼WUS 基因的cDNA 全长序列，将其命名为DlWUS（GenBank登录号为KM017506）。以龙眼胚性愈伤组织DNA为模板，以全长引物扩增获得1 805bp的DNA 序列，与cDNA 序列比对表明，其包含2个内含子和3个外显子。

2．2 DlWUS 基因的生物信息学分析

利用DNAMAN 6．0和ORF Finder分析，龙眼DlWUS 基因cDNA 全长1 110bp，包括102bp的5′－UTR、150bp的3′－UTR（含poly A）和858bp的开放阅读框，共编码285 个氨基酸，起始密码子为ATG，终止密码子为TAG。利用ExPASy Protpara、SignalP 4．1Server和TMpred Server在线软件对DlWUS 编码的氨基酸序列进行分析，结果显示：该蛋白分子式为C1368H2069N391O453S11，分子量为31 593．4 Da，理 论 等 电 点5．68，不 稳 定 系 数 为49．60，总平均疏水性为－0．873，不具有信号肽，在169～191位置间存在一个长度23bp、由内向外的跨膜螺旋，分值为660，由此推测该蛋白为不稳定亲水酸性跨膜蛋白，且不属于分泌型蛋白。使用WoLF PSORT 在线软件预测DlWUS的亚细胞定位，结果显示：DlWUS 定位于细胞核的可能性最大。用NetPhos 2．0Server对DlWUS 基因翻译后修饰预测，结果显示：该蛋白具有23个磷酸化位点（Ser16，Thr3，Tyr4）。

WUS属于同源异型结构域（homeodomain）蛋白超级家族，通过NCBI Blastp 预测龙眼DlWUS的保守结构域，结果表明，龙眼DlWUS具有Homeodomain结构域，在肽链的第26～92 位氨基酸间（图1）。利用COILS Server对DlWUS形成的卷曲螺旋的倾向性进行预测，结果表明DlWUS在200～250位氨基酸间极易形成卷曲螺旋。利用SOPMA在线软件对DlWUS进行二级结构预测，结果表明：DlWUS的二级结构由20%α－螺旋、3．16%β－转角、10．18%延伸链和66．67%无规则卷曲组成。为了更全面的了解DlWUS 编码的蛋白的特性，利用DNAMAN 6．0将其与其他物种该蛋白进行多重比对，发现DlWUS 具有WUS转录因子的保守序列：WUS box和EAR－like位点（图2），进一步表明Dl－WUS 属于典型的WUS 转录因子。

2．3 DlWUS 基因编码的蛋白同源性及进化分析

将龙眼DlWUS 基因推导的氨基酸序列经NCBI Blastp 比 对 分 析 发 现，DlWUS 与 大 豆（Glycine max）、蓖 麻（Ricinus communis L．）、脐 橙（Citrus sinensis）的同源性相对较高，分别在58%、61%和56%。为了进一步了解龙眼DlWUS 的进化关系，本研究选择经NCBI Blastp 比对，与DlWUS 同源性较高的13种植物，采用MEGA 5．2中的N－J法构建系统进化树（图3）。结果表明，根据种属关系，WUS可分为两大类，单子叶植物聚为一类，双子叶植物聚为一类，而龙眼与脐橙的亲缘关系最近，聚在一个分支内。

2．4 龙眼DlWUS 在不同体胚阶段中的表达分析

采用实时荧光定量PCR 分析DlWUS 在龙眼胚性愈伤组织、不完全胚性紧实结构、球形胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶胚共6个阶段的相对表达。结果（图4，A）表明，虽然DlWUS 在这6个阶段均有响应，但是DlWUS 在胚胎发育早期（胚性愈伤组织和不完全胚性紧实结构）的相对表达量很低，而在球形胚时期的表达量达到最高，说明龙眼体细胞胚胎发生过程中，DlWUS 主要在球形胚时期表达。

图1 DlWUS 的保守结构域Fig．1 The conserved domain of DlWUS

图2 DlWUS 与其他物种WUS 基因编码的氨基酸的多重比对图中物种名称按顺序分别为：龙眼，大豆，脐橙，梅，烟草，葡萄，苜蓿，莲，毛白杨；Homeodomain、WUS box与EAR－like是WUS的保守结构域Fig．2 Alignment of amino acid sequences of DlWUS with WUSfrom other species Above the species name according to the order：Dimocarpus longan，Glycine max，Citrus sinensis，Prunus mume，Nicotiana sylvestris，Vitis vinifera，Medicago truncatula，Nelumbo nucifera，Populus tomentosa；，respectively；Homeodomain，WUS box and EAR－like are the conservative domain of WUS

2．5 龙眼DlWUS 在不同激素（IAA／GA3／SA）浓度处理下的表达分析

植物激素在植物生长发育过程中扮演了重要角色，参与调节植物生命活动的许多环节，为了了解IAA、SA 和GA3对龙眼DlWUS 表达的影响，利用实时荧光定量PCR 技术分析了不同激素浓度处理后DlWUS 表达的变化。结果表明：在设置的4个IAA 浓度梯度内，与对照相比，DlWUS 基因的表达均有所提高，并且当外源施加IAA 浓度达到1．0 mg／L时，DlWUS 的相对表达量增加显著（图4，B）。经不同GA3浓度处理后，当GA3浓度小于等于12mg／L 时，GA3可促进DlWUS 的表达，并且在12mg／L时，促进效果最明显；而当外源施加的GA3浓度达到25mg／L 时，对DlWUS 表达的促进作用消失（图4，C）。经不同SA 浓度处理后，与对照相比，低浓度（≤50μmol／L）SA 处理的龙眼胚性愈伤组织中DlWUS 的表达量明显下降，而当SA浓度达到100μmol／L 时，相对于对照组，DlWUS的表达量略高（图4，D）。

图3 WUS系统进化树图中分支点的数字表示Bootstrap验证中基于1 000次重复该节点可信度Fig．3 Phylogenetic tree of WUS The number at the nodes represents the reliability percent of bootstrap values based on 1 000replications

图4 DlWUS 在龙眼体细胞胚胎发生过程及不同激素（IAA、GA3、SA）处理下的相对表达A．龙眼体细胞胚胎发生过程DlWUS mRNA 的相对表达：1．胚性愈伤组织；2．不完全胚性紧实结构；3．球形胚；4．心形胚；5．鱼雷形胚；6．子叶胚；B．外源IAA 处理；C．外源GA3 处理；D．外源SA 处理Fig．4 Relative expressions of DlWUSat different stages of longan SE and different concentrations of IAA／GA3／SA A．Relative expressions of DlWUSat different stages of longan SE（1．The friable－embryogenic callus；2．Incomplere compact pro－embryogenic cultures；3．Globular embryos；4．Heart embryos；5．Torpedo embryos；6．Cotyledonary embryos）；B．Different concentrations of IAA；C．Different concentrations of GA3；D．Different concentrations of SA

3 讨 论

3．1 DlWUS 参与龙眼体细胞胚胎发生并调控体细胞胚胎发育后期的形态建成

生物信息学分析表明：DlWUS 编码的蛋白具有WUS 转录因子特有的保守序列WUS box 和EAR－like位点，其都属于抑制型结构域，在WUS 基因中WUS box发挥主要作用，缺失WUS box的突变体植株丧失了异位表达WUS 形成体细胞胚胎的功能［20］。另外Zhang等［21］在拟南芥、水稻等植物WOX 家族基因的研究中发现，WUS box是WOX家族中对植物分生组织具有调控作用的成员特有的序列，由此推断龙眼DlWUS 基因可能在诱导植物形成体细胞胚中发挥作用，并且参与植物分生组织的调控。

在拟南芥的研究中发现，WUS 最早在16－细胞早 期球形 胚 时 期 开 始 表 达［10，22－23］，而CLV3 的 表 达则稍晚于WUS，在心形胚时期才开始表达［24－26］。本研究对DlWUS 进行实时荧光定量PCR 分析结果表明，在龙眼体细胞胚胎发生过程中，虽然DlWUS在体细胞胚胎发生6个阶段中均有反应，但除了在球形胚时期其转录水平较高外，其他5个阶段其转录水平都较低，说明在体细胞胚胎发生过程中Dl－WUS 主要在球形胚时期发挥作用，并影响后期体胚的形态建成。陈春玲等［27］研究发现，在龙眼体细胞胚胎发生过程中，內源IAA 主要在胚性愈伤组织和球形胚时期累积，但由于PIN1蛋白在球形胚时期才开始表达促发生长素的极性运输［1，28］，而WUS的表达受生长素浓度梯度的调控，因此推测在球形胚时期，PIN1蛋白的极性定位促使IAA 极性运输并呈梯度分布进而诱导了WUS 的表达，而WUS 基因的表达又启动了CLV3 基因的表达，由于CLV3与WUS 间的负反馈调节作用，使得体胚发育后期DlWUS 的表达维持在一个相对稳定的状态，并且推测在龙眼心形胚时期很可能有干细胞的形成，即开始形成胚根、胚芽原基。

3．2 外源激素影响龙眼DlWUS 的表达

3．2．1 外源IAA 改变DlWUS 的表达 生长素是植物生长发育所必须的內源激素，也是目前已知的可以调控植物干细胞的外源信号［29］。生长素浓度梯度与PIN1蛋白对生长素极性运输的调控对诱导WUS 表达和体细胞胚胎发生至关重要［30］。PINs蛋白的极性定位影响生长素的区域分布，同时区域性的施加生长素也能诱导PINs蛋白的表达，改变PINs蛋白的极性定位［30－33］。在PIN1蛋白介导下，植物体内的生长素进行极性运输，形成生长素浓度梯度，在生长素浓度梯度的特定区域，诱导WUS 的表达，进而诱导形成体细胞胚［1，34－35］。WUS 的表达需要特定的生长素浓度，在这个临界值范围内，外源生长素诱导了WUS 的表达，因而确定外源生长素施加的浓度范围显得尤其重要。在本试验中，不同浓度的外源IAA 处理后，相较于对照，龙眼胚性愈伤组织中DlWUS 的表达量明显有所提高，并且在外源施加IAA 浓度为1．0 mg／L 时表达量达到峰值，是对照的35倍左右。由此推测，在龙眼体细胞胚胎发生过程中，外源IAA 诱导PIN1蛋白极性重建，生长素浓度梯度重新分配，从而促进了DlWUS的表达，并且很有可能外源施加IAA 的浓度在1．0 mg／L左右是诱导DlWUS 表达的一个临界点。

3．2．2 外源施加低浓度GA3促进DlWUS 的表达 赤霉素是植物生长发育过程中的一种重要激素，参与植物生命周期中的多个生物过程，包括种子萌发，茎的生长等［36］。在本试验中，经不同浓度的外源GA3处理后，DlWUS 的表达相较于对照有所提高，并且在外源施加GA3浓度达到12 mg／L 时达到峰值，是对照的2．5倍左右，说明DlWUS 对外源施加赤霉素有积极的响应，并且DlWUSDNA 的内含子中含有赤霉素应答元件P－box，由此初步推断外源施加低浓度的GA3可以促进DlWUS 的表达，进而在植物体细胞胚胎发生过程中发挥作用。

3．2．3 外源施加低浓度SA 抑制DlWUS 的表达 水杨酸作为一种广泛存在于植物体内的一种內源信号分子，是提高植物抗逆性的重要激素之一，在外源施加一定浓度范围内对诱导植物体细胞胚也有促进作用，但是不同的植物需要的诱导浓度不同。Hosseini等［37］的研究认为外源施加低浓度的SA 可促进胡萝卜体细胞胚的形成，而高浓度的SA 则抑制体细胞胚的形成；在Luo等［38］对沙打旺进行研究时发现，当外源施加SA 150μmol／L 时，其体细胞胚胎发生频率最高。本试验结果表明，在外源施加SA 浓 度 低 于100μmol／L 时，DlWUS 的 表 达 量 都受到不同程度的抑制，并且在50μmol／L 时抑制效果最明显，这与匡华琴［39］的研究认为外源水杨酸抑制WUS 表达的结论基本相符，而当外源施加SA 浓度达到100μmol／L时，DlWUS 的表达量相对于对照略有提高。初步推测，在龙眼体细胞胚胎发生过程中，外源施加低浓度的SA 抑制了DlWUS 的表达，进而对龙眼体胚的生长发育进行调控，而外源施加较高浓度的SA 对DlWUS 是否有促进作用还有待进一步的试验证明。

［1］ 刘玉博．细胞分裂素和生长素调控拟南芥体细胞胚根端分生组织建立的分子基础［D］．山东安泰：山东农业大学，2011．

［2］ KIEFFER M，STERN Y，COOK H，et al．Analysis of the transcription factor WUSCHELand its functional homologue in Antirrhinumreveals a potential mechanism for their roles in meristem maintenance［J］．The Plant Cell Online，2006，18（3）：560－573．

［3］ LAUX T，MAYER K，BERGER J，et al．The WUSCHEL gene is required for shoot and floral meristem integrity in Arabidopsis［J］．Development，1996，122（1）：87－96．

［4］ VAN DER GRAAFF E，LAUX T，RENSING S A．The WUS homeobox－containing（WOX）protein family［J］．Genome Biol．，2009，10（12）：248．

［5］ HAECKER A，GROB－HARDT R，GEIGES B，et al．Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana［J］．Development，2004，131（3）：657－668．

［6］ MAYER K F，SCHOOF H，HAECKER A，et al．Role of WUSCHELin regulating stem cell fate in the Arabidopsis shoot meristem［J］．Cell，1998，95（6）：805－815．

［7］ YADAV R K，PERALES M，GRUEL J，et al．WUSCHEL protein movement mediates stem cell homeostasis in the Arabidopsis shoot apex［J］．Genes ＆Development，2011，25（19）：2 025－2 030．

［8］ GALLOIS J L，NORA F R，MIZUKAMI Y，et al．WUSCHEL induces shoot stem cell activity and developmental plasticity in the root meristem［J］．Genes ＆Development，2004，18（4）：375－380．

［9］ BOUCHABKE－COUSSA O，OBELLIANNE M，LINDERME D，et al．WUSCHEL overexpression promotes somatic embryogenesis and induces organogenesis in cotton（Gossypium hirsutum L．）tissues cultured in vitro［J］．Plant Cell Reports，2013，32（5）：675－686．

［10］ ZUO J，NIU Q W，FRUGIS G，et al．The WUSCHEL gene promotes vegetative－to－embryonic transition in Arabidopsis［J］．The Plant Journal，2002，30（3）：349－359．

［11］ ZHENG W，ZHANG X，YANG Z，et al．AtWUSCHELpromotes formation of the embryogenic callus in Gossypium hirsutum［J］．PloS One，2014，9（1）：e87502．

［12］ LAI ZH X（赖钟雄），CHEN ZH G（陈振光）．Somatic embryogenesis of high frequency from longan embryogenic calli［J］．Journal of Fujian Agricultural University（福建农业大学学报），1997，26（3）：271－276（in Chinese）．

［13］ LAI ZH X（赖钟雄），PAN L ZH（潘良镇），CHEN ZH G（陈振光）．Establishment and maintenance of longan embryogenic cell lines［J］．Journal of Fujian Agricultural University（福建农业大学学报），1997，26（2）：160－167（in Chinese）．

［14］ CHEN CH L陈春玲LAI ZH X赖钟雄．Synchronization regulation of embryogenesis of embryogenic calli and their histological observations in longan［J］．Journal of Fujian Agriculture and Forestry University（Nat．Sci．Edi．）（福 建农林 大 学学报·自然科 学 版），2002，31（2）：192－194（in Chinese）．

［15］ LAI ZH X，LIN Y L．Analysis of the global transcriptome of longan（Dimocarpus longan Lour．）embryogenic callus using Illumina paired－end sequencing［J］．BMC Genomics，2013，14（1）：561．

［16］ 曾丽兰．龙眼胚性愈伤组织SOD 的表达分析及启动子功能鉴定［D］．福州：福建农林大学，2013．

［17］ WANG F H（王凤华），L ZH X（赖钟雄），ZHENG J G（郑金贵），et al．Synchronization control of somatic embryogenesis from embryogenic calli and extraction of DNA and RNA in longan（Dimocarpus longan Lour．）［J］．Chinese Journal of Tropical Crops（热带作物学报），2003，24（3）：33－37（in Chinese）．

［18］ LIN Y，LAI Z．Reference gene selection for qPCR analysis during somatic embryogenesis in longan tree［J］．Plant Science，2010，178（4）：359－365．

［19］ VANDESOMPELE J，DE PRETER K，PATTYN F，et al．Accurate normalization of real－time quantitative RT－PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes［J］．Genome Biology，2002，3（7）：research0034．

［20］ IKEDA M，MITSUDA N，OHME－TAKAGI M．Arabidopsis WUSCHEL is a bifunctional transcription factor that acts as a repressor in stem cell regulation and as an activator in floral patterning［J］．The Plant Cell Online，2009，21（11）：3493－3505．

［21］ ZHANG X，ZONG J，LIU J，et al．Genome－wide analysis of WOX gene family in rice，sorghum，maize，Arabidopsis and poplar［J］．Journal of Integrative Plant Biology，2010，52（11）：1 016－1 026．

［22］ WEIGEL D，JURGENS G．Stem cells that make stems［J］．Nature，2002，415（6 873）：751－754．

［23］ CHENG Z J，ZHU S S，GAO X Q，et al．Cytokinin and auxin regulates WUS induction and inflorescence regeneration in vitroin Arabidopsis［J］．Plant Cell Reports，2010，29（8）：927－933．

［24］ FLETCHER J C，BRAND U，RUNNING M P，et al．Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3in Arabidopsis shoot meristems［J］．Science，1999，283（5 409）：1 911－1 914．

［25］ TUCKER M R，HINZE A，TUCKER E J，et al．Vascular signalling mediated by ZWILLEpotentiates WUSCHELfunction during shoot meristem stem cell development in the Arabidopsis embryo［J］．Development，2008，135（17）：2 839－2 843．

［26］ BOSCA S，KNAUER S，LAUX T．Embryonic development in Arabidopsis thaliana：from the zygote division to the shoot meristem［J］．Frontiers in Plant Science，2011，2．

［27］ CHEN CH L（陈春玲），LAI ZH X（赖钟雄）．The changes of endogenous hormones in the process of somatic embryogenesis in Longan（Dimocarpus longan Lour．）［J］．Chinese Journal of Tropical Crops（热带作物学报），2002，23（2）：41－47（in Chinese）．

［28］ SU Y H，LIU Y B，ZHANG X S．Auxin－cytokinin interaction regulates meristem development［J］．Molecular Plant，2011，4（4）：616－625．

［29］ SHANI E，YANAI O，ORI N．The role of hormones in shoot apical meristem function［J］．Current Opinion in Plant Biology，2006，9（5）：484－489．

［30］ 程志娟．细胞分裂素与生长素之间的互作决定拟南芥离体再生苗的干细胞特征［D］．山东安泰：山东农业大学，2009．

［31］ SAUER M，BALLA J，LUSCHNIG C，et al．Canalization of auxin flow by Aux／IAA－ARF－dependent feedback regulation of PIN polarity［J］．Genes ＆Development，2006，20（20）：2 902－2 911．

［32］ VIETEN A，VANNESTE S，WISNIEWSKA J，et al．Functional redundancy of PIN proteins is accompanied by auxin－dependent crossregulation of PIN expression［J］．Development，2005，132（20）：4 521－4 531．

［33］ XU J，HOFHUIS H，HEIDSTRA R，et al．A molecular framework for plant regeneration［J］．Science，2006，311（5 759）：385－388．

［34］ SU Y H，ZHAO X Y，LIU Y B，et al．Auxin－induced WUS expression is essential for embryonic stem cell renewal during somatic embryogenesis in Arabidopsis［J］．The Plant Journal，2009，59（3）：448－460．

［35］ BLILOU I，XU J，WILDWATER M，et al．The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsis roots［J］．Nature，2005，433（7021）：39－44．

［36］ YAXLEY J R，ROSS J J，SHERRIFF L J，et al．Gibberellin biosynthesis mutations and root development in pea［J］．Plant Physiology，2001，125（2）：627－633．

［37］ HOSSEINI S，MASHAYEKHI K，ALIZADEH M，et al．Effect of salicylic acid on somatic embryogenesis and chlorogenic acid levels of carrot（Daucus carota cv．Nantes）explants［J］．Journal of Ornamental and Horticultural Plants，2011，1（2）：105－113．

［38］ LUO J P，JIANG S T，PAN L J．Enhanced somatic embryogenesis by salicylic acid of Astragalus adsurgens Pall．：relationship with H2O2production and H2O2metabolizing enzyme activities［J］．Plant Science，2001，161（1）：125－132．

［39］ 匡华琴．马银花等杜鹃花组织培养及干细胞相关基因克隆与表达［D］．福州：福建农林大学，2014．