PrepFilerTM提取甲醛固定石蜡包埋组织检测STR分型1例

刘亚举，张丽娟

（1.许昌市公安局刑事科学技术研究所，河南 许昌461000；2.长葛市公安局刑侦大队，河南 长葛461500）

诉讼与案例
Litigation and Case Report

PrepFilerTM提取甲醛固定石蜡包埋组织检测STR分型1例

刘亚举1，张丽娟2

（1.许昌市公安局刑事科学技术研究所，河南 许昌461000；2.长葛市公安局刑侦大队，河南 长葛461500）

法医遗传学；Prepfiler磁珠法；甲醛；石蜡包埋组织；STR分型

1 案例

1.1 简要案情

2004年7月某日下午，张某（女，25岁，小区内业主）与杨某（男，57岁，小区公用车棚门卫）因故吵架，杨某倒地后死亡。法医病理检验显示，杨某系冠状动脉粥样硬化性心脏病而死亡。死者家属不服死因结论，多次上访，8年后有关部门将死者心肾器官的石蜡包埋病理组织送至DNA实验室要求检验鉴定。

1.2 检验过程及结果

取石蜡包埋组织适量，放入1.5mL的离心管中，加入生理盐水800μL，漩涡震荡30 s，65℃以900 r/min振摇保温20min，12 000 r/min离心1min，弃上清，重复上面步骤2次。参照美国AB公司PrepFiler试剂盒手工操作步骤：（1）裂解：在该离心管内加入裂解液300μL和1M的DTT 3μL，漩涡震荡5 s，离心10 s，70℃以900 r/min振摇保温40min。（2）去除承载体：在新的1.5mL离心管中装上LySepTM过滤柱，取上述裂解产物300μL于LySepTM过滤柱中，12 000 r/min离心1min，弃掉LySepTM过滤柱。（3）磁珠结合DNA：在上述滤液中加入混匀的磁珠悬液15μL，1000 r/min漩涡震荡10s，离心10s；再加入异丙醇180μL，1000 r/min漩涡震荡5 s，短暂离心；室温以1000 r/min振摇结合10min。（4）洗涤：10000 r/min漩涡震荡10s，离心10s，将离心管置于磁力架上，2min后吸去液体；加入洗涤液300μL，取下离心管，10000 r/min漩涡震荡5 s，离心10 s，再置于磁力架上，50 s后吸去液体，重复该步骤2次；最后在磁力架上，打开管盖，室温干燥已结合DNA的磁珠8min。（5）洗脱DNA：加入洗脱液50μL，10 000 r/min漩涡震荡5 s，离心10 s；70℃以900 r/min振摇保温5min，10 000 r/min漩涡震荡2 s，离心10 s；置于磁力架上，1min后吸取DNA溶液备用。

采用IdentifilerPlus试剂盒（美国AB公司）10μL体系，在9700型扩增仪（美国AB公司）上标准程序进行复合扩增，扩增产物在3500XL型遗传分析仪（美国AB公司）上检测，用GeneMapper ID-X软件（美国AB公司）进行STR分型。结果显示，PrepFiler磁珠法得到了完整STR分型，并且STR峰型尖锐清晰、平衡性好（见图1），与死者血样STR分型一致。

图1 PrepFiler磁珠法甲醛固定石蜡包埋组织STR分型

2 讨论

甲醛固定石蜡包埋组织的DNA检验，既要尽量减少组织额外的损伤，又要保证组织中的DNA被释放，最佳的方法应该是：无毒、快速、经济且能回收到高纯度的DNA，但是符合上述要求的“通用”方法不存在，那么就要建立有效的方法。主要的脱蜡方法有：（1）有机溶剂法：在二甲苯中浸泡脱蜡，但其有毒，而且操作过程复杂，容易引起外源性污染；（2）水浴加热法：将石蜡包埋组织加入到生理盐水或TES溶液（10mmol Tris-HCL、1mmol EDTA、0.5%SDS）中，65℃10min或56℃ 30min使石蜡溶解，加热时间越长，DNA受损越严重，由于组织受热不均，也会脱蜡不彻底。在本案中，考虑到组织比较有脆性，就选择了简单的脱蜡法，将包埋组织加入到生理盐水中65℃保温20min，为使组织受热均匀脱蜡彻底，在保温的过程中以900 rpm振摇离心管。

对于DNA提取方法的选择，常用的是小体积Chelex100+PK法、QIAGEN硅胶模法、IQ磁珠法[1]和酚氯仿法、C-有-柱法（Chelex法后，经酚氯仿法浓缩，再过Microcon-100柱）[2]。不管何种方法，目的就是去除抑制剂、提高DNA大片段回收率，得到高纯度的DNA模板。本案中，PrepFiler试剂盒使用的DNA提取与纯化方法是关键，它采用高效的裂解液，在DTT协同下，将组织中的DNA充分释放，同时含有DNA的裂解液能流过LySepTM柱专利滤膜，其它底物被保留在柱子上；而磁珠是多聚体修饰的复合化学物质包埋的磁性颗粒，粒径小，均一程度高，表面积大、磁响应性好，胶质稳定性、重分散性好，不易沉淀，使DNA与磁性颗粒能完全地结合，经过特殊配方的洗涤液，最大程度地去除了抑制剂；经修饰的磁珠表面功能基团，偶联得到的DNA产量和质量很高，并对DNA产量均一化，使用50μL洗脱体积，避免了后续STR小片段的优势扩增，保证了STR复合扩增的均衡性。最后是STR扩增试剂盒的选择，在本案中，使用的IDPlus试剂盒提高了抗PCR抑制能力、提高了扩增信号、减少了PCR伪峰，经29个循环，结果是STR分型完整，并且STR峰型尖锐清晰、平衡性好，与死者血样STR分型一致。

[1]柳燕，李莉，赵珍敏，等.甲醛固定石蜡包埋组织STR分型检测[J].法医学杂志，2009，25（5）：337-340.

[2]刘德衍，杨锋，袁磊，等.甲醛固定石蜡包埋组织DNA提取方法比较[J].中国法医学杂志，2011，26（6）：465-467.

（本文编辑：李成涛）

司法部司法鉴定科学技术研究所2015年教学培训计划

DF795.4

B

10.3969/j.issn.1671-2072.2015.02.026

1671-2072-（2015）02-0123-02

2013-04-25

刘亚举（1978—），男，主检法医师，主要从事法医物证检验及鉴定工作。E-mail：horse3697@126.com。