谷氨酰胺合成酶抑制剂对烤烟烘烤特性的影响

刘化冰，何文苗，尚晓颍，程昌合＊，张晓兵，慕继瑞，杨铁钊

（1 浙江中烟工业有限责任公司技术中心，杭州310008；2 河南农业大学 烟草学院，郑州450002）

由于烤烟生产是以叶片为收获目标，烟叶成熟采收和烘烤是烤烟生产的关键环节。烟草叶片在成熟过程中，其生物学特性、生理生化特性和主要化学组成不断发生变化［1－3］，而这些变化直接影响着不同成熟度烟叶的烘烤特性和烤后烟叶质量［4］。氮素是影响烟叶产量和品质的重要营养元素之一［5－6］，在烟叶成熟期氮素吸收量过大会使烟株生长过旺，氮代谢延长，烟叶成熟期推迟，造成烟叶品质低劣［7］。谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）是一种控制氮代谢的酶，它是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP和Mg2＋存在下催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。抑制剂（草铵膦）的靶标酶是GS［8］，其作用是通过降低GS 活性，减少氮素化合物的合成。抑制剂在植物体内传导能力强，半衰期短［9］，而且对哺乳动物安全［10］。相关研究表明，GS抑制剂（草铵膦）处理小麦叶片后，叶片氮含量显著下降，并转移到其他器官［11］。目前关于烤烟施氮水平和烟叶成熟度等对烟叶烘烤特性影响的研究已有报道［12－13］，但是通过GS抑制剂来调控烤烟烘烤特性的研究鲜见报道。因此，本试验以中等耐氮烤烟品种‘K326’为材料，在烟叶采收之前通过喷施不同浓度的GS抑制剂（草铵膦），研究烟叶烘烤特性的变化，为指导优质烟叶生产提供参考。

1 材料和方法

1．1 试验材料与设计

试验于2011年在河南农业大学科教园区（郑州）进行，采用盆栽培养方法。供试土壤为壤质潮土（取自河南农业大学科教园区），耕层土壤的基本理化性状为有机质9．58g／kg、全氮0．87g／kg、速效氮64．46mg／kg、速效磷25．42 mg／kg、速效钾105．00 mg／kg，pH 7．88。参试烤烟品种为‘K326’。5月15日选取生长一致的壮苗，分别移栽于装有15kg土壤的塑料盆中，每盆1 株。分别施用分析纯NH4NO3、NaH2PO4和K2SO4，N、P、K 的用量分别为0．13、0．13、0．39g／kg，穴施，在移栽时、移栽后第1周、第2周分3次施入，3次施肥量比例为2∶1∶1。试验用盆栽烟株共300株，常规水分管理。

各选取整齐一致的单株100 株，以第11 片叶（自下向上数）为试验对象，在达到工艺成熟期前7d分别用质量分数为0．005%和0．01%的GS抑制剂（4－［羟基（甲基）膦酰基］－D／L－高丙氨酸）［11］均匀喷施叶片2次，每片烟叶20mL，以清水处理为对照。处理植株叶片一部分放在暗箱（抽屉）中进行暗箱试验，常温下每隔24h观察其变色情况，对其变黄和变褐情况进行观察记录；另一部分按照三段式烘烤工艺进行烘烤，分别于烤前（0h）和开烤后每隔24h取样1次，各项指标取样测定重复3次。

1．2 测定项目与方法

叶片叶绿素、类胡萝卜素含量测定采用分光光度法；叶片含水量测定采用杀青烘干法；多酚氧化酶（PPO）活性测定采用邻苯二酚氧化分光光度法，以单位质量烟叶每分钟内吸光度值（OD420）变化0．001为一个酶活力单位（U）；丙二醛含量测定采用硫代巴比妥酸比色法［14］。叶片自由水和束缚水含量测定采用称重法［15］。

比叶重测定采用烘干称重法：用直径为1cm 打孔器沿叶片主脉两侧对称打取50 片圆片，3 次重复，先于烘箱中105℃杀青20min，再于60℃烘箱中烘干至恒重，然后称量干重，计算比叶重［16－17］。

按42级国标对烤后烟叶进行质量评价。

1．3 数据处理

采用SPASS 17．0 数据处理系统和Microsoft Excel 2003软件对数据进行分析。

2 结果与分析

2．1 GS抑制剂对烤后烟外观质量的影响

烤后烟叶的外观质量是烟叶烘烤特性的外在表现。从表1可知，GS抑制剂喷施后，显著提高了烤后烟叶中黄烟比例，减少了杂色烟比例；且随着GS抑制剂浓度升高，促使微带青和青黄烟比例升高。

2．2 GS抑制剂对烘烤过程中烟叶变黄特性的影响

烟叶变黄特性主要与叶片叶绿素和类胡萝卜素降解有关［18］，烤烟品种易烤性的差异主要体现在烟叶质体色素降解的不同。图1显示，GS抑制剂处理后烟叶叶绿素含量、类胡萝卜素含量显著低于对照，并在烘烤过程中也始终显著低于对照，且高浓度抑制剂处理降低的幅度更大；GS 抑制剂处理的叶绿素与类胡萝卜素的比值在烘烤前高于对照，在烘烤过程中低于对照，且差异极显著（P＜0．01）；类胡萝卜素的降解速率和降解量明显比叶绿素慢，约为叶绿素的1／3。综合上述烤后烟叶外观质量（表1）发现，烘烤过程中烟叶质体色素的降解与烟叶变黄密切相关，烤后烟叶质体色素含量与受烤前含量的影响，以及叶绿素和类胡萝卜素的相互协调与平稳降解是烟叶烤黄的关键。

表1 GS抑制剂对烤后烟外观质量的影响Table 1 Effects of GS Inhibitor to flue－cured tobacco’s appearance quality

2．3 GS抑制剂对烘烤过程中烟叶失水特性的影响

含水量、自由水和束缚水含量是决定烟叶失水速率的重要因素之一，失水特性主要表现在失水速率不同［19］。由图2可知，在烘烤前（0h），抑制剂处理烟叶含水量和束缚水含量比对照极显著降低（P＜0．01），其自由水含量在0．05%处理下比对照显著增加，而在0．01%处理下差异不显著；在烘烤48 h之后，抑制剂处理烟叶含水量和自由水含量均极显著低于对照，其束缚水含量则极显著高于对照；在烘烤48～72h间，各指标含量均显著低于对照。同时，抑制剂处理烟叶失水速率在烘烤0～48h间极显著大于对照，在烘烤48～72h间则与对照差异不显著或显著低于对照，烘烤72h后则极显著低于对照。以上结果说明GS抑制剂有利于提高烟叶在烘烤过程中的失水速率。

图1 不同处理烘烤过程中烟叶变黄特性的变化动态Fig．1 Variation of yellowing characters during curing process

2．4 GS抑制剂对烘烤过程中烟叶定色特性的影响

在烟草中，酚类物质大部分呈多酚状态存在，以葡萄糖苷和酯的形式存在，在烘烤期间由于酚糖苷的热解作用和酶促分解，烤烟酚类物质的变化十分剧烈，并最终影响烤后烟叶的颜色［20］，定色期多酚氧化酶（PPO）活性过高会造成烟叶挂灰和黑糟等［21］。鲜烟叶的PPO 活性在一定程度上可以代表烟叶的耐熟程度［22］。图3 显示，各处理烟叶PPO活性在烘烤过程中整体均呈现先上升后下降的趋势，但GS抑制剂处理烟叶始终极显著低于对照，且高浓度GS抑制剂处理的活性在烘烤前和烘烤过程中多低于或者显著低于低浓度处理。

2．5 GS抑制剂对烘烤过程中烟叶衰老特性的影响

图2 不同处理烘烤过程中烟叶失水特性的变化动态Fig．2 Variation of dehydrating properties during curing process

丙二醛（MDA）是细胞膜脂过氧化的最终产物，其含量与叶片衰老程度有关，直接反映细胞的膜脂过氧化水平和烟叶衰老情况［23］。烟叶烘烤过程中MDA 含量变化有差异，烟叶衰老速度影响烟叶物质转化和失水干燥，进而影响烟叶烘烤特性和烤后烟叶质量。图4显示，在烘烤前和烘烤过程中，GS抑制剂处理的烟叶MDA 含量始终极显著高于对照，且抑制剂浓度越高升高的幅度越大。这说明GS抑制剂有利于加速烟叶细胞衰老，从而增加了细胞膜的通透性。

2．6 喷施GS抑制剂成熟鲜烟叶在暗箱条件下的变黄特性

图3 不同处理烘烤过程中烟叶PPO 活性的变化动态Fig．3 Variation of polyphenol oxidase activity during curing time

图4 不同处理烘烤过程中烟叶MDA 含量的变化动态Fig．4 Variation of MDA content during curing time

表2 GS抑制剂对烤烟暗箱试验的影响Table 2 Effects of GS inhibitor to flue－cured tobacco coloring time under dark condition

暗箱条件下烟叶的变黄特性反映了烟叶实际烘烤中的烘烤特性。烟叶变黄时间的长短反映了烟叶的变黄特性，时间短则表明烟叶容易变黄，易烤性好，时间长则说明烟叶变黄较慢，易烤性不太理想；烟叶变黄后维持其黄色状态而不变褐的时间长短反映了烟叶的耐烤性。表2显示，GS抑制剂处理的烟叶在暗箱内比对照更容易变黄，在变黄30%、变黄100%和变褐30%三个阶段两个处理和对照之间差异极显著，而且从100%变黄到变褐持续的时间明显增长，说明经过抑制剂处理的离体叶片在暗箱条件下比对照变黄时间短，容易变黄，而不容易变褐，即喷施GS抑制剂有利于改善烟叶的烘烤特性。

3 讨 论

相关研究表明，GS 抑制剂能降低植物叶片的氮素合成量，使营养物质合成减少，并加速了营养物质的转移［11，24］。在烘烤过程中烟叶变黄达一定程度之后，叶片快速失水，控制乃至终止酶的活动，将烟叶的黄色固定下来。本研究结果表明，叶绿素含量与黄烟比例呈显著负相关，GS 抑制剂有利于提高烤后叶片的黄烟比例，质体色素降解速率快、降解量大；烘烤过程中烟叶变黄快，烤后黄烟率高易烤性提高。说明适当浓度的GS抑制剂有利于叶绿素和类胡萝卜素的降解，有利于烟叶黄色的显现［25］。

成熟烟叶烘烤过程中失水特性、烘烤失水调控及失水与品质有密切关系［26］。在烘烤过程中，失水过快，会使烟叶死亡过快，阻碍生化反应进行，烟叶将被烤青或烤褐［27］。本试验表明，用GS抑制剂后烟叶含水量增高，但失水速度加快，后期含水量低，即GS抑制剂使烟叶养分降解，内含物不充实，烟叶更容易失水。再结合本试验中GS抑制剂浓度增大以后，微带青和青黄烟的比例有所上升的结果，表明GS抑制剂加速叶片衰老，使烟叶失水过快，造成定色期缩短。说明适宜浓度的GS抑制剂处理有利于烟叶易烤性的提高，但并非浓度越高越好。

PPO 活性是烤烟定色的关键因素，本试验结果表明，GS抑制剂明显降低了烘烤前和烘烤过程中烟叶的PPO 活性，同时增加了MDA 含量，使膜脂过氧化程度加深，烘烤过程中叶片的衰老程度加深［25］。同时，暗箱试验结果表明，GS抑制剂处理的叶片更容易变黄，且从变黄到变褐的时间加长，即烟叶对环境的耐受性增强，烟叶耐烤性提高。由于GS抑制剂浓度增加而青烟比例上升，而且作物对GS抑制剂的反应不同，因此在实际生产中应根据烤烟的栽培条件、品种及成熟度等因素选择合适的GS抑制剂浓度［28］，具体还有待进一步研究。

综上所述，GS抑制剂促进了质体色素的降解，加快了烘烤过程中烟叶的失水速度，降低了PPO 活性，使烘烤前烟叶的成熟度有明显的提高，烤后烟叶黄烟比例提高，杂色烟减少，对烟叶易烤性和耐烤性都有明显的改善，且GS抑制剂浓度升高烘烤特性增强，但是青烟比例增加。因此，应根据品种及烟叶的成熟度等因素选择合适的GS抑制剂施用浓度。

［1］NIE R B（聂荣邦），LI H F（李海峰），HU Z SH（胡子述），etal．Studies on the tissue of fresh flue－cured tobacco leaves with diferent maturity［J］．TobaccoScience＆Technology（烟草科技），1997，（3）：37－40（in Chinese）．

［2］HAN J F（韩锦峰），GONG CH R（宫长荣），HUANG H T（黄海堂），etal．A study on maturity of tobacco leaves I physiological and biochemical changes of tobacco leaves in maturity and senescence［J］．ChineseTobaccoScience（中国烟草科学），1990，（1）：25－28（in Chinese）．

［3］RAN B D（冉邦定），LIU J Y（刘敬业），LI T F（李天福），etal．Study on dynamics of five enzymes of fule－crued tobacco‘K326’during ripening［J］．ActaTabacariaSinica（中国烟草学报），1993，1（4）：26－28（in Chinese）．

［4］HAN J F（韩锦峰），GONG CH R（宫长荣），etal．A preliminary study on the Maturity，the anatomical structure and heat reaction to curing of the flue－cured tobacco［J］．JournalofHenanAgriculturalUniversity（河南农业大学学报），1987，21（4）：405－409（in Chinese）．

［5］DONG Y Q（窦玉青），CHEN G（陈 刚），WANG SH SH（王树声），etal．The effect of nitrogen regulators on tobacco leaf and soil available nitrogen［J］．ChineseTobaccoScience（中国烟草科学），2006，（3）：6－9（in Chinese）．

［6］LI CH J（李春俭），ZHANG F S（张福锁），LI W Q（李文卿），etal．Nitrogen management and its relation to leaf quality in production of flue－cured tobacco in China［J］．PlantNutritionandFertilizerScience（植物营养与肥料学报），2007，13（2）：331－337（in Chinese）．

［7］SHI H ZH（史宏志），HAN J F（韩锦锋），etal．Discussion on several problems about carbon and nitrogen metabolism in flue－cured tobacco［J］．TobaccoScienceandTechnology（烟草科技），1998，（2）：34－36（in Chinese）．

［8］BELLINDER R R，HATZIONS K K，etal．Mode of action investigations with the herbicides HOE－39866and SC－0224［J］．WeedSci．，1985，33：779－785．

［9］FABER M J，STEPHENSON G R，THOMPSON D G．Persistence and leachability of glufosinate－ammonium in a Northern Ontario terrestrial environment［J］．Agric．FoodChem．，1997，45：3 672－3 676．

［10］TACHIBANA K，WATANABA T，etal．Accumulation of ammonia in plants treated with bialaphos［J］．Pestic．Sci．，1986，11：33－37．

［11］YANG T G（杨铁钢），DAI T B（戴 廷波），CAO W X（曹 卫星），etal．Research on nitrogen assimilation after anthesis in high and low grain protein wheat cultivars［J］．ActaEcologicaSinica（生态学报），2008，28（5）：2 357－2 364（in Chinese）．

［12］CAI X J（蔡宪杰），WANG X M（王信民），YIN Q SH（尹启生），etal．Study on the quantitative relationship between maturity and quality of tobacco leaf［J］．ActaTabacariaSinica（中国烟草学报），2005，11（4）：42－46（in Chinese）．

［13］SUN F SH（孙福山），WANG L Q（王丽卿），LIU W（刘 伟），etal．a1．Correlation ofleafmaturing，key curing index and quality of tobacco［J］．ChineseTobaccoScience（中国烟草科学），2002，（3）：25－27（in Chinese）．

［14］邹 琦．植物生理学实验指导［M］．北京：中国农业出版社，2000：67－174．

［15］WANG CH Y（王传义），ZHANG ZH F（张忠峰），XU X H（徐秀红），etal．Comparison of free water measurement methods in tobacco leaves［J］．ChineseTobaccoScience（中国烟草科学），2008，29（3）：25－27（in Chinese）．

［16］RAN B D（冉邦定），LIU J Y（刘敬业），LI T F（李天福），etal．The relationship between matutity，amount of fertilizer，number of leaves harvested and structure of tobacco leaf，specific leaf weight［J］．ChineseTobaccoScience（中国烟草科学），1993，（2）：2－6（in Chinese）．

［17］LIU X S（刘雪松），LIU ZH Q（刘贞琦），LIU ZH Y（刘振业），etal．Changes of specific leaf weight and net photosynthetic rate of tobacco［J］．PlantPhysiologyCommunications（植物生理学通讯），1991，27（4）：279－281（in Chinese）．

［18］SONG CH P（宋朝鹏），WU SH J（武圣江），GAO Y（高 远），etal．The degradation mechanism of carotenoids in flue－cured tobacco and the changes of the related aroma components in the yellowing stage during the bulk curing process［J］．ScientiaAgriculturaSinica（中国农业科学），2010，43（20）：4 246－4 254（in Chinese）．

［19］GONG CH R（宫长荣），WANG X J（王 晓剑），etal．Study on the moisture content change and physiological mechanism in tobacco leaf during flue－curing process［J］．JournalofHenanAgriculturalUniversity（河南农业大学学报），2000，34（3）：229－231（in Chinese）．

［20］GONG CH R（宫长荣），WANG A H（王爱华），etal．Changes of polyphenols in tobacco leaves during the flue－curing process and relative analysis of some chemical components［J］．ScientiaAgriculturaSinica（中国农业科学），2005，38（11）：2 316－2 320（in Chinese）．

［21］A KENURST B C．Tobacco［M］．New York and London：New York University Press，1981：616－618．

［22］BATE－SMITH E C．The commoner phenolic constituents of plants and their systematic distribution［J］．JournalofRoyalDublinSociety ofProceedingScience，1956，27：75－165．

［23］GONG CH R（宫长荣），WANG Y F（汪耀富），CHEN J H（陈江华），etal．Characteristies of membrane lipid peroxidation in tobacco leaves during curing and its effect on quality［J］．ChineseTobaccoScience（中国烟草科学），1999，（3）：11－15（in Chinese）．

［24］YANG T G（杨铁钢），DAI T B（戴廷波），etal．Effects of GS inhibitor glufosinate on carbon and nitrogen assimilation during wheat grain－filling under different nitrogen supply［J］．JournalofTriticeaeCrops（麦类作物学报），2007，27（4）：671－676（in Chinese）．

［25］GONG CH R（宫长荣），YUAN H T（袁红涛），CHEN J H（陈江华），etal．Studies on activity of amylase and degradation of starch and pigment in tobacco leaf during the process of curing［J］．ActaTabacariaSinica（中国烟草学报），2002，8（2）：16－20（in Chinese）．

［26］WANG ZH G（王正刚），SUN J Q（孙敬权），YONG J X（庸经祥），etal．Study on characteristics and control of fully developed tobacco leaf desiccation in curing process［J］．ChineseTobaccoScience（中国烟草科学），1999，（2）：1－4（in Chinese）．

［27］SHEEN S J．Incoporation of leaf chemical constituents into tobacco brown pigments［J］．Beitr．Ztabakforch，1978，9（4）：248．

［28］SU SH Q（苏少泉）．Glufosinate review［J］．ChineseJournalofPesticides（农药），2005，44（12）：529－532（in Chinese）．