香蕉MaPIP2－6基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

侯晓婉，胡 伟，颜 彦，徐碧玉，金志强＊

（1 海南大学 农学院，海口570228；2 中国热带农业科学院热带生物技术研究所，农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室，海口571101）

香蕉是热带和亚热带发展中国家最重要的作物之一，具有很高的营养、经济和药用价值，被联合国粮农组织列为世界第四大粮食作物。因其特有的浅根和需要大量水份维持的永久性绿色树冠，香蕉对任何条件引起的水份缺失异常敏感［1］。很多非生物胁迫，如低温、干旱、盐害均可能导致细胞脱水，因此研究香蕉如何响应非生物胁迫的危害显得尤为重要。

水是任何生命细胞最重要的组成成分，是所有有机体中的主要溶剂。水在植物体不同组织之间通过质外体和共质体途径完成运输［2］。质外体途径运输主要是通过环境因素，如土壤、植物、大气之间水电位的变化实现的［3］；而共质体途径运输则主要是通过水通道蛋白（aquaporin，AQP）亚家族实现的［4］。AQP通过增加膜的渗透性有效地促进了高等植物体内水分子在膜之间的运输，调节着种子的萌发、细胞伸长、气孔的开闭和韧皮部的装载和卸载、生殖生长和植物的胁迫响应［5－6］。

在植物中，AQP 属于膜内嵌蛋白（a class of major intrinsic proteins，MIP）的一个大的亚家族，被划分为4个分支，分别为质膜内嵌蛋白（the plasma membrane intrinsic proteins，PIPs）、液泡膜内嵌蛋白（the tonoplast intrinsic proteins，TIPs）、小碱性膜内嵌蛋白（the recently characterized small basic intrinsic proteins，SIPs）和 类nodulin 26膜内嵌蛋白（the NOD－26－like intrinsic proteins，NIPs）［7－9］。所 有4 个分支均有高度保守的结构域——6个跨膜α螺旋被连接在N 端和C 端总是朝向细胞质基质的5个短环上［2］。在水份选择通道形成中起重要作用的保守天冬酰胺－脯氨酸－丙氨酸元件存在于其中两个短环上［10］。在水稻、拟南芥等物种中已证明AQP 家族基因能在转录水平受逆境胁迫诱导，在植物对逆境胁迫应答中发挥重要作用［11－12］，但在香蕉中AQP家族基因的研究还非常有限。

本研究从香蕉中克隆出一个MaPIP2－6基因，并对其在逆境胁迫及ABA 处理下的表达模式作研究，为进一步研究MaPIP2－6基因功能奠定基础。

1 材料和方法

1．1 材 料

生长正常的巴西蕉（MusaAAA Cavendish cv．Brazilian）和粉蕉（MusaABB Pisang Awak）的五叶一心期幼苗，取自中国热带农业科学院儋州组培中心。

1．2 目的基因的获得

从香蕉A 基因组测序数据库中得到一个AQP家族基因（GSMUA＿Achr1T02360），根据ORF 序列设计1 对引物MaPIP2－6F1 和MaPIP2－6R1（表1），扩增MaPIP2－6cDNA 全长序列。PCR 扩增程序为：95℃预变性5s；94℃变性40s；55℃退火40 s；72℃延伸1min 30s；共35个循环。按照分子克隆实验指南进行PCR 扩增产物回收、连接、转化，挑取单克隆在LB 液体培养基中培养并进行PCR 鉴定［13］。对已鉴定的阳性克隆进行测序分析。

1．3 生物信息学分析

在NCBI中利用BLASTX 进行序列同源性分析，从中选取相似性较高的同源序列用DNAMAN软件进行氨基酸序列的多重比对，利用MEGA 5．0软件对水稻AQP基因家族和克隆出的MaPIP2－6基因构建系统发育树。

1．4 MaPIP2－6亚细胞定位分析

1．4．1 瞬时表达载体构建 根据目的基因MaPIP2－6序列设计带有NcolⅠ／SpeⅠ酶切位点且不含终止子的引物MaPIP2－6F2和MaPIP2－6R2（表1）。以正常生长的巴西蕉幼苗叶片cDNA 为模版进行扩增，将扩增产物回收后连接到克隆载体pMD18－T（Takara公司）上，获得重组质粒，阳性克隆测序正确后，用NcolⅠ／SpeⅠ进行双酶切并回收目的片段。同时，利用NcolⅠ／SpeⅠ双酶切并回收的pCAMBIA1302 载体大片段。利用购自BioLab试剂公司的T4连接酶将目的片段和载体片段进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α（天根生化科技有限公司）感受态细胞后，挑取单克隆扩大培养，经PCR 和质粒双酶切验证后，进行测序分析，构建成植物表达载体pCAMBIA1302－MaPIP2－6－GFP。将测序正确的阳性克隆的质粒以及pCAMBIA1302空载体质粒分别转入农杆菌LBA4404中。

1．4．2 农杆菌介导的亚细胞定位 利用农杆菌介导的瞬时转化法将pCAMBIA1302－MaPIP2－6－GFP和空载体（pCAMBIA1302－GFP）导入洋葱表皮细胞中［14］。随后将洋葱表皮放在铺有滤纸的MS培养基上，25℃暗培养16～24h，然后制作装片，通过FluoViewTMFV1000激光扫描共聚焦显微镜观察荧光信号。

表1 PCR 扩增所用引物及其序列Table 1 Primers and sequences required in PCR amplification

1．5 基因的表达分析

将生长一致的五叶一心期的巴西蕉和粉蕉幼苗分别分成4组。第1组将300 mmol／L 甘露醇（上海生工生物工程有限公司）持续浇在放置香蕉幼苗的托盘中，处理7、10、15、17d；第2组将300mmol／L NaCl持续浇在放置香蕉幼苗的托盘中，处理8、12、24、32d；第3组将香蕉幼苗放置在8℃的低温培养箱中，持续往托盘中浇清水，冷害下处理10、22、47h，之后将处理47h的幼苗置于人工气候培养箱中恢复1周；第4组用100μmol／L ABA 喷洒香蕉幼苗，处理2、6、12、24h。参照淦国英改良的CTAB 法［15］提取每个处理时间点的香蕉叶片RNA，用自带DNA 消化酶的cDNA 反转录试剂盒（Takara公司）反转成cDNA。以反转录的cDNA第一链为模板，用TaKaRa 公司的实时荧光定量PCR 试剂盒中的SYBR Green、ROX 染料进行实时荧光定量PCR 扩增，反应在吉泰生物科技有限公司Mx3005P荧光定量PCR 仪上进行。以香蕉RPS2基因为内参，定量方法为2－ΔΔCt法［16］。设计引物参考TaKaRa实时荧光定量标准说明书。为了保证引物的特异性，在非翻译区设计引物MaPIP2－6F3／MaPIP2－6R3及MuRPS2F／MuRPS2R（表1），PCR产物的长度维持在300bp 以内，并进行了测序分析。引物交由上海生工生物工程有限公司合成。荧光定量PCR 的反应程序如下：95℃预变性3min；95℃变性10s，50℃退火15s，72℃延伸30s，循环40次。

2 结果与分析

2．1 MaPIP 2－6的克隆及序列分析

图1 MaPIP2－6与水稻AQP家族成员的系统发育进化树Fig．1 Phylogenetic tree of MaPIP2－6 and AQP proteins from rice

以正常生长的巴西蕉幼苗叶片cDNA 为模版、MaPIP2－6F1和MaPIP2－6R1为引物，从香蕉栽培品种巴西蕉中克隆到一个AQP 家族基因，其ORF为849bp，编码282个氨基酸。从GENBANK 中选择水稻的全部33 个AQP 家族成员及获得的香蕉AQP基因推测的氨基酸序列，利用MEGA 5．0软件构建系统发育树（图1），结果表明本研究得到的香蕉AQP基因所编码的氨基酸序列与OsPIP2－6具有较近的亲缘关系，故将该基因命名为MaPIP2－6。BLASTX 分析表明，MaPIP2－6 编码的氨基酸序列与姜花HcPIP2（AEF32110．1）、野生稻Ob－PIP2－6（XP＿006664814．1）、海枣PdPIP2－6（XP＿008809438．1）编码的氨基酸序列具有较高的一致性，分别为93%、89%和87%（图2）。多序列比对分析表明，MaPIP2－6编码的蛋白具有PIP 亚家族蛋白的基本特征，其氨基酸序列同样有6个保守的跨膜螺旋，5 个短环，一个高度保守的氨基酸序列‘HINPAVTFG’和2 个‘NPA’元件。另外，在MaPIP2－6中也观察到了所有PIP 成员中共有的保守序列（R／K）DYX（E／D）PP（P／R）X3－4（E／D）XXELXXWSF（Y／W）R。这些结果表明获得的MaPIP2－6为香蕉PIP亚家族的成员（图2）。

2．2 MaPIP2－6蛋白的亚细胞定位分析

以构建的MaPIP2－6 基因的植物表达载体pCAMBIA1302－MaPIP2－6－GFP，利用农杆菌介 导的瞬时转化法将其和空载体（pCAMBIA1302－GFP）导入洋葱表皮细胞中，对MaPIP2－6蛋白在植物亚细胞结构中的分布进行研究，25℃暗培养16～24h后，在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白信号在细胞内的分布，结果显示35S：GFP绿色荧光蛋白在洋葱表皮细胞的细胞质、细胞核和细胞膜上均有表达（图3，A），而35S：MaPIP2－6－GFP仅在洋葱表皮细胞的细胞膜上表达（图3，B），表明MaPIP2－6蛋白定位在细胞膜上。

2．3 MaPIP 2－6基因在非生物逆境胁迫及ABA 处理下的表达分析

利用实时定量PCR 的方法对MaPIP2－6基因在甘露醇、低温、NaCl、ABA 处理下表达模式的分析结果表明，在甘露醇处理下，与对照相比，巴西蕉中MaPIP2－6基因的表达在处理7d被抑制，处理7～15d呈逐渐上升趋势，随后在处理17d后下降；粉蕉中MaPIP2－6 基因的表达趋势与在巴西蕉中相似，但是在0、10、15、17d处理时间点的表达量都高于巴西蕉（图4，A）。在低温处理下，巴西蕉中MaPIP2－6基因的表达与对照相比在处理10h、22 h和恢复5d没有明显变化，处理47h显著降低；粉蕉中MaPIP2－6基因的表达与对照相比在处理10 h、22h和恢复5d明显降低，但在处理47h没有明显变化（图4，B）。在NaCl 处理下，巴西蕉中，MaPIP2－6基因的表达在处理8d显著降低，处理12d升高，随后在处理24d下降；粉蕉中MaPIP2－6基因的表达趋势与在巴西蕉中相似，但是在每个处理时间点的表达量都低于巴西蕉（图4，C）。在ABA处理下，与对照相比，巴西蕉中，MaPIP2－6基；因的表达在处理2～12h 显著被诱导；粉蕉中，MaPIP2－6基因的表达在处理2～24h显著被抑制（图4，D）。

图3 MaPIP2－6亚细胞定位结果Fig．3 Subcellular localization of MaPIP2－6fused with GFP

图4 不同处理下MaPIP2－6基因的相对表达量Fig．4 Relative expression of MaPIP2－6after different treatments

3 讨 论

近年来AQP 家族基因的功能已经广泛被报道，但是关于香蕉中AQP 家族基因的研究非常有限。本研究从香蕉中克隆了一个AQP 基因（MaPIP2－6），该基因编码的氨基酸序列具有AQP家族蛋白的基本特征，与其它物种中AQP 家族成员具有较高的一致性，与水稻OsPIP2－6具有较近的进化关系。亚细胞定位分析表明，MaPIP2－6编码蛋白定位于细胞膜上，与MaPIP1；1和TaAQP7等AQP基因编码蛋白的细胞定位结果一致［17－18］，进一步说明了MaPIP2－6具有PIP蛋白的特征。因此，可以推测本研究所克隆的基因是AQP 家族中PIP2亚类中的一个成员。

大量的研究表明AQP家族基因能够调节植物体内水分的平衡，在植物对逆境胁迫的应答中发挥着重要作用。在烟草中过表达的TaAQP7、Ta－AQP8增强了转基因植株对干旱、高盐和低温胁迫的耐受性［18－21］。在拟南芥中过表达的TaNIP和杜鹃花的AQP增强了植株高盐和低温的耐受性［20－22］。而且，这些基因都能在转录水平受相关非生物逆境胁迫诱导。因此，本研究运用实时荧光定量PCR 的方法研究了香蕉MaPIP2－6基因在转录水平对甘露醇、低温、高盐和ABA 的应答。结果表明，在甘露醇和高盐胁迫处理下，巴西蕉和粉蕉的表达趋势基本一致，在处理早期轻微下降，随后被诱导并达到最大值，然后下降。这一结果表明，该基因在响应渗透胁迫的过程中，可能在早期出现了一个‘Shock’，随后呈现出被诱导的趋势。这一诱导的趋势 与Lei等［23］报 道OsPIP1－1 和OsPIP2－5 在PEG－6000胁迫下的表达趋势一致，而且OsPIP1－1在转基因拟南芥中的过表达增强了其对盐和干旱的耐受性。

在低温处理下，粉蕉中MaPIP2－6基因的表达量在处理前期下降，但之后又增加，在处理47h增加到接近0h处理的表达量。这一表达趋势与Gao等报道TaNIP在低温胁迫下的表达趋势一致［20］。巴西蕉中MaPIP2－6基因的表达在处理47h达到最小值，在处理的其它时间点没有显著变化。因此，巴西蕉和粉蕉中MaPIP2－6的表达趋势相反，说明该基因在巴西蕉和粉蕉中的作用方式可能不同。在拟南芥中，低温胁迫能够诱导AtPIP2；5 和At－PIP2；6 基因表达，但是却抑制了AtPIP1；1，At－PIP1；2，AtPIP1；5，AtPIP2；2，AtPIP2；3，At－PIP2；4和AtPIP2；7 基因的表达［24］。因此，AQP家族成员对低温胁迫的响应表现出不同的模式。而且，在非生物逆境胁迫下，相同的AQP基因在不同品种中也具有不同的表达模式和不同的功能。因此，MaPIP2－6在巴西蕉和粉蕉中的抗逆功能仍有待于进一步研究。

在ABA 处理下，与处理0h对照相比较，巴西蕉和粉蕉中MaPIP2－6 的表达趋势完全相反，MaPIP2－6在巴西蕉中显著被诱导，在粉蕉中则显著被抑制。巴西蕉中MaPIP2－6的表达趋势与Lei研究的水稻在ABA 处理后叶片中OsPIP1－1、Os－PIP1－2、OsPIP2－1、OsPIP2－3、OsPIP2－4 和Os－PIP2－5的表达趋势一致［23］。粉蕉中MaPIP2－6的表达趋势与Lei研究的水稻在ABA 处理后根中OsPIP1－1、OsPIP1－3、OsPIP2－2、OsPIP2－3、Os－PIP2－4和OsPIP2－5的表达趋势一致［23］。这些结果表明，MaPIP2－6 在巴西蕉和粉蕉中对ABA 的响应方式不同。

综上所述，本研究克隆到的MaPIP2－6基因是AQP家族PIP2亚类中的一个，具备PIP2亚家族蛋白的结构特征。实时荧光定量PCR 实验表明MaPIP2－6在转录水平响应了甘露醇、低温、NaCl和ABA 信号。这些结果表明MaPIP2－6能够参与非生物逆境胁迫应答，为进一步研究MaPIP2－6基因的功能奠定了基础。

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