紫花苜蓿叶输导组织解剖结构和光合特性对外源氮的响应

张晓玲，刘晓静＊，郝 凤

（1 甘肃农业大学 草业学院，兰州730070；2 草业生态系统教育部重点实验室／中美草地畜牧业可持续发展研究中心，兰州730070）

植物叶片自建立光合能力起，光合产物的运移就由输导组织维管束来完成［1］，因此叶片的光合能力及输导组织对光合产物及营养物质的运输能力是作物高产的重要基础［2］。植物叶片解剖结构对外源氮素的响应已有研究，但多集中于大豆［3］、小麦［4］和玉米［5］等作物，且研究目标均为叶栅栏组织和海绵组织对外源氮素的响应，而针对氮素对植物叶输导组织的影响方面的研究极少。植物的光合能力受多种因素的影响，已证实氮素可促进植物光合能力，如氮素通过调节光合电子传递能力和光合羧化酶的活性而影响光合速率的高 低［6］。在水稻［7］、玉米［8］和小麦［9－10］上的研究都表明施氮有利于提高叶片叶绿素含量和净光合速率。植物体的形态、结构和生理功能是统一的，光合作用的差异也必然与叶片光合作用器官的解剖学特性紧密相关［11］。因此，关于植物叶片养分输导能力和光合性能的研究对作物高产优质生产具有重要意义。

紫花苜蓿（MedicagosativaL.）是重要的豆科牧草，与其它牧草相比，因其富含植物性蛋白且高产，被誉为“牧草之王”［12］。随着畜牧业的发展，蛋白饲料严重不足已成为畜牧业生产的瓶颈问题。紫花苜蓿的叶集中体现了其营养价值，是蛋白含量最高、纤维含量最低、适口性最好的部位，并且又是进行物质合成的场所，叶功能直接决定着其营养品质，开展紫花苜蓿叶片输导组织解剖结构和光合特性的研究极具现实意义。有研究发现，适当的氮素可促进紫花苜蓿结瘤固氮，NH4＋－N 使根系明显变短、加粗，促进侧根的形成，从而增强紫花苜蓿营养吸收，促进其生物量的积累［13］，粗蛋白含量也随之提高［14］；同时，施氮能促进紫花苜蓿根瘤形成，增加其固 氮能力［15］，并 能 促 进 其 地 上 部 的 光 合 作 用［16－17］。外源氮在提高紫花苜蓿生物量［18］和种子产量［19］，提高干物质积累和氮积累［20］，改善紫花苜蓿品质等方面的作用卓著［21］，本试验研究了不同供氮条件下紫花苜蓿叶片输导组织解剖结构和光合特性，探究其结构与功能的关系，以揭示外源氮促进紫花苜蓿高效生产的本质，为生产提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试紫花苜蓿品种为‘甘农3 号’（Medicago sativaL.cv.Gannong No.3）和‘陇东苜蓿’（MedicagosativaL.cv.Longdong），供试菌株为中华根瘤菌（12531），源自苜蓿根瘤和诱变菌株，来源于甘肃农业大学草业学院。‘甘农3号’由甘肃农业大学草业学院育成，抗旱、耐寒，再生能力强，肥料报酬率高，是灌区的丰产品种，适合于西北内陆灌溉农业区［22－23］。‘陇东苜蓿’是地方品种，栽培历史悠久，抗旱性较强，耐寒，长寿，适应性强，在旱作条件下高产，主要分布于甘肃陇东地区，宜在旱作地区种植［24］。

1.2 材料准备

1.2.1 根瘤菌培养 将中华根瘤菌（12531）采用平板划线培养，挑起单个菌落，将其接入YMA 液体培养基［25］。在28 ℃下120r·min－1的恒温摇床上培养至菌液的光密度值（OD600nm）≥1.0，再在10 000r·min－1下离心10 min，除去上清液用无菌水洗下根瘤菌体并配制成吸光值为0.6的菌悬液，备用。

1.2.2 种子处理 选取大小均匀、颗粒饱满的紫花苜蓿种子放入灭菌小三角瓶中，先用95%乙醇浸泡5min，再用0.1% HgCl2溶液灭菌6～10min，然后无菌水冲洗5～6 次后用无菌滤纸吸干，备用［26］。

1.2.3 粗砂处理 将粗砂经自来水冲洗若干次，直到冲洗至水不再浑浊，然后用蒸馏水冲2～3次。先经121 ℃灭菌，再经高温（150 ℃）烘干后，备用。

1.2.4 营养液配置 以Fahraeus无氮营养液［27］为基本营养液，加入Ca（NO3）2、（NH4）2SO4分别作为来源，调节营养液pH 为7，结合无氮营养液一同施入。

1.3 材料培养与处理

根据前期试验结果［28］，两个紫花苜蓿品种各设2种氮素形态、5 个浓度水平（0、105、210、315、420mg·L－1），共9个处理，分别以CK（氮 素 水 平 为0）、表示，每处理重复15 次，完全随机排列。

试验在室外防雨网室内采用盆栽营养液砂培法进行。选用高15cm、长20cm、宽12cm 的花盆，装入经自来水冲洗，再用蒸馏水清洗并灭菌的粗砂3 kg。2014年4月11日播种，每盆播种50粒灭菌种子，播种7d后间苗，每盆留苗30株，然后开始浇入营养液，每周浇250mL，每7d用蒸馏水淋洗盆栽1次以防止砂培中盐分积累，而后浇入新配置营养液。紫花苜蓿生长至三片复叶时，每盆接种新培养的苜蓿根瘤菌液25 mL。培养60d时紫花苜蓿已到初花期，大部分已经现蕾，此时取样测定各指标。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 叶片解剖结构 取第3叶位之三出复叶中间小叶，将新鲜的叶片立即在FAA 固定液中固定并保存，采用常规石蜡切片技术，先经酒精系列脱水，二甲苯透明，石蜡包埋后，LEICA 全自动切片机切片，厚度10μm，充分烤片后，进行番红－固绿双重对染，中性树胶封片。切片制作完毕，置于Carl Zeiss光学显微镜下观察并拍照（图1），并利用Axio－Vision软件测微尺测量维管束、木质部、韧皮部面积［29］及导管数量，每个处理选取3 个样本，每个样本随机取10个视野求平均值。

1.4.2 叶片光合生理特性 叶片净光合速率、气孔导度和胞间CO2浓度采用GFS－3000 光合仪（Walz，Germany）测定，测定时间为上午9：00～11：00；叶面积采用描形称重法测定［30］；叶绿素含量采用丙酮浸提法测定［31］。

1.5 数据处理

采用Excel 2003 软件进行数据的整理，应用SPSS17.0对数据进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同氮素处理对紫花苜蓿叶片输导组织解剖结构的影响

图1 不同氮素处理下紫花苜蓿叶片解剖结构（×200；标尺＝50μm）Fig.1 Different nitrogen treatments on anatomical structure of alfalfa leaf（×200；Scale bars＝50μm）

相比于CK（图1，A、B），供氮条件下‘甘农3号’和‘陇东苜蓿’（图1，C－R）的叶表皮由长圆形排列更为紧密的单层细胞组成，叶脉凸起明显，横截面积较大，维管束在横截面中所占比例增大，木质部和韧皮部发达。木质部有孔径较大细胞壁加厚的木质导管，且数量多并呈放射状排列。厚角组织细胞大且数量多。随着供氮水平的增高，2品种、2氮素形态下紫花苜蓿维管束面积、木质部面积、韧皮部面积和导管数均呈先增加后降低的趋势，并均在210 mg·L－1供氮水平下表现最大（图1，G－J，表1）。

2.2 不同氮素处理对紫花苜蓿光合特性的影响

图2 不同氮素处理对紫花苜蓿光合特性的影响Fig.2 Effects of different nitrogen treatments on photosynthetic characteristics of alfalfa

表1 不同氮素处理对紫花苜蓿叶片解剖结构的影响Table1 Effects of different nitrogen treatments on anatomical structure of alfalfa leaf

表2 不同氮素处理对紫花苜蓿叶面积和叶绿素含量的影响Table2 Effects of different nitrogen treatments on leaf area and chlorophyll content of alfalfa

2.2.1 净光合速率、气孔导度和胞间CO2浓度 从图2可看出，氮素对紫花苜蓿叶片光合性能有明显的调节作用。其净光合速率（Pn）和气孔导度（Gs）变化规律一致，供氮处理均显著高于CK（P＜0.05），并随供氮水平的增加呈先增后减趋势，在210mg·L－1供氮水平下达到峰值。同一氮素水平下，除‘陇东苜蓿’在315mg·L－1和420mg·L－1水平 下 的 净 光 合 速 率 表 现 为培 养 高 于培养，其余各处理均为培养高于培养。因此，在处理下，叶片净光合速率和气孔导度对氮素反应最为敏感。对于2品种来说，除培养下315mg·L－1和420 mg·L－1水平的光合速率表现为‘陇东苜蓿’高于‘甘农3号’外，其他各处理光合速率、气孔导度则均表现为‘甘农3号’高于‘陇东苜蓿’。另外，紫花苜蓿胞间二氧化碳浓度（Ci）则与净光合速率表现大体呈相反趋势，随氮素水平的提高而降低。

2.2.2 叶面积和叶绿素含量 由表2可见，不同供氮处理下‘甘农3号’和‘陇东苜蓿’叶面积、叶绿素含量变化趋势一致，供氮处理均显著高于CK（P＜0.05）。2种氮素形态下，均随供氮水平的增高呈先增加后降低的趋势，并在210mg·L－1供氮水平下达到峰值。同一氮素水平下，整体上表现为N 培养高于培养。因此，2品种紫花苜蓿的叶面积、叶绿素含量均在N、210mg·L－1达最大值。对于2品种来说，各处理的叶面积、叶绿素含量表现为‘甘农3 号’高于‘陇东苜蓿’；在N、210mg·L－1浓度时，‘甘农3号’的叶面积、叶绿素含量分别为1.56cm2、2.18mg·g－1，与‘陇东苜蓿’相比分别增加了6.1%、14.1%。

3 讨 论

3.1 紫花苜蓿叶片输导组织结构对氮素的响应

叶片组织结构决定组织功能［32］，维管束的大小决定紫花苜蓿运输养分的能力。本研究中，供氮处理的紫花苜蓿叶片木质部面积、韧皮部面积及导管数量均显著高于无氮处理，可见紫花苜蓿输导组织对养分的丰缺有适应性的响应。宋朝玉等［33］在玉米上的研究也发现叶片向果穗输送光合产物也受到氮素的调控，从而影响产量。本试验中，在供氮水平≤210mg·L－1时，紫花苜蓿木质部面积、韧皮部面积及导管数量与供氮水平呈正相关，但供氮水平＞210mg·L－1时各指标有所下降，说明适宜的氮素水平可促进紫花苜蓿维管束细胞的增大，从而增强输导组织对养分的运输能力，进而影响叶片光合速率和光合产物运输效率，表现在植株叶面积的增大。这与陈火英等［5］对爆裂型玉米的研究结果相似。此外，紫花苜蓿在培养下的木质部面积、韧皮部 面积及导 管 数 量 大 于培 养，说 明更有利于促进细胞体积的增大、维管束的发育。陈冬梅［34］在不同氮源对白羽扇豆根系解剖结构上的研究上也得出了相同的结论。因此，、210 mg·L－1处理最有利于提高紫花苜蓿养分运输的能力。

3.2 紫花苜蓿光合特性对氮素的响应

有研究证实影响光合速率的因素有2个［35］，一是气孔因素，二是叶肉细胞羧化能力，核酮糖－1，5－二磷酸羧化酶（RuBPCase）是碳同化途径关键酶，氮素通过影响RuBPCase的活性，进而影响电子传递的速率。当光合速率和胞间CO2浓度变化相同时，光合速率的影响原因是气孔的限制；当光合速率和胞间CO2浓度变化趋势相反，则归因于叶肉细胞的羧化能力。本研究结果表明，随着氮素浓度的增加，紫花苜蓿叶片的净光合速率和胞间CO2浓度变化趋势相反，表明氮素对紫花苜蓿光合速率的影响是由于叶肉细胞羧化能力的改变而致。栗娜娜等［36］在对青花菜的研究中发现氮素是通过影响光合机构或暗反应酶活性来影响其光合作用，施氮会使光合作用中重要的RuBP 羧化酶数量上升，从而提高光合作用。本研究中，供氮水平在210mg·L－1时，叶片净光合速率最大，表明适宜的氮素水平可促进紫花苜蓿的光合作用效率。吴家胜等［37］对银杏叶片光合速率的研究结论与此一致。与此同时，紫花苜蓿在培养下的光合速率高于培养，郭培国等［38］等对烤烟研究发现随比例增加，叶片中的希尔反应活力逐渐上升，光合磷酸化活力也有所升高，从而提高了水的光解和电子传递的速率，因此增加比例有利于光合能力的提高。Raab等［39］也发现甜菜叶片的光合速率在营养下比在营养下高。可见不同的氮素形态对紫花苜蓿的光合特性的影响不同，且作用更佳。因此，、210 mg·L－1处理更大程度提高紫花苜蓿光合特性。

3.3 不同紫花苜蓿品种解剖结构和光合特性对氮素的响应

植物叶片形成的光合同化物在韧皮部中运输时，韧皮部横截面积和源库路径长度是运输能力的主要决定因子［40］，因而维管束的发育程度会限制光合同化物的运输能力，古世禄等［41］对谷子的研究中也证实了该结论。植物输导组织的发达程度可以衡量营养物质的运转效率，当其通道能力达到饱和时，便会限制其生长速度，即所谓的“输导限制”［42］。因此，在本研究中2品种紫花苜蓿输导组织维管束面积和净光合速率均在处理最大，说明紫花苜蓿维管束的通道能力在处理下达到饱和，输导组织运送养分的能力最强，光合产物的运输效率最高，从而优化了其光合特性，促进了其光合效率。2品种相比，氮素对‘甘农3号’叶片输导组织的改善作用和光合作用均大于‘陇东苜蓿’，说明‘甘农3号’较‘陇东苜蓿’对氮肥更敏感，肥料报酬率高。曹致中［22］认为‘甘农3号’紫花苜蓿生产性能优良，高产，对肥料利用效率也较突出，适应于西北内陆灌溉农业区和黄土高原地区栽培。刘艳楠等［43］在施肥与刈割对不同紫花苜蓿品种生产性能的影响中也得出相同的结论。Carlson等［44］、Sheridan［45］也报道了不同苜蓿品种光合速率明显不同，高产苜蓿具有较高比叶重和净光合速率。因此，氮素对紫花苜蓿养分运输能力和光合作用的改变上也存在品种差异。

综上所述，氮素能通过改善紫花苜蓿叶片输导组织的解剖结构和光合特性，促进紫花苜蓿光合作用效率，提高紫花苜蓿运输营养物质和合成有机物的能力、改善其生产性能和营养品质；相同氮素水平，比的改善效果更佳，并以、210 mg·L－1处理表现最优；品种间相比，‘甘农3号’较‘陇东苜蓿’对氮肥反应更敏感，受到调控的效果更好。

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