pBIN438—CMV△Rep表达载体的构建及其在根癌农杆菌中的转化

雷霄飞+杨学领

摘 要：用PCR方法扩增黄瓜花叶病毒部分复制酶基因（CMV△Rep），连接到PUCm-T载体上构建成克隆载体PUCm-T-CMV△Rep。用BamHⅠ和SalⅠ分别对克隆载体PUCm-T-CMV△Rep和植物表达载体pBIN438进行双酶切，获得目的片段和线性质粒。在T4 DNA连接酶的作用下进行定向连接，构建成植物表达载体pBIN438- CMV△Rep。采用CaCl2冻融法将重组子导入根癌农杆菌LBA4404。经PCR和双酶切鉴定，表明重组质粒pBIN438- CMV△Rep已成功导入根癌农杆菌中。

关键词：复制酶基因；载体构建； 农杆菌； 黄瓜花叶病毒

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2015）08-13-02

PBIN438-CMV△Rep Expression Vector and its Transformation in Agrobacterium Tumefaciens

Lei Xiaofei et al.

（Department of science and technology， Wuhan Bioengineering Institute，Wuhan 430415，China）

Abstract：Cucumber mosaic virus partial replicase gene were amplified by PCR （CMV Rep），connected to the PUCm-T vector to construct the cloning vector of PUCm-T-CMV Rep. With BamH I and Sal I of PUCm-T-CMV cloning vector Rep and the plant expression vector pBIN438 were digested， obtained fragment and linear plasmid. Directional connection in T4 DNA ligase， a plant expression vector was constructed by pBIN438-CMV Rep. Using CaCl2 freeze-thaw method the recombinant plasmid into Agrobacterium LBA4404. By PCR and double enzyme digestion showed that the recombinant plasmid， pBIN438- CMV Rep has been successfully introduced into Agrobacterium tumefaciens.

Key words：Replicase gene； Vector construction； Agrobacterium tumefaciens；Cucumber mosaic virus

黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）是一种寄主范围非常广泛的病毒，可以侵染多种经济类作物，导致减产甚至绝产。利用基因工程技术将病毒本身的一部分基因转化至植物基因组中获得具有抗病性的植株是当前病毒病防治的主要途径[1-2]。

本实验利用PCR技术获黄瓜花叶病毒CMV△Rep基因片段，在此基础上构建含有该序列的植物表达载体pBIN438-CMV△Rep，为利用基因沉默技术进行植物广谱抗病研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 大肠杆菌DH5a，根癌农杆菌LBA4404和质粒pBIN438；PUCm-T载体、T4 DNA连接酶、限制性内切酶BamHⅠ、SmaⅠ等均购自Fermentas公司。

1.2 方法

1.2.1 含CMV△Rep基因质粒DNA的制备 挑取含有载体pCAMBIA1302-CMV△Rep的单菌落接种于LB液体培养基中，37℃振荡过夜培养，根据碱裂解法提取质粒，用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，于-20℃保存备用。

1.2.2 带特定酶切位点的CMV△Rep基因的引物设计与合成 依据CMV△Rep基因的序列设计扩增引物，引物的合成、测序分析工作均由大连宝生物公司完成。Rep-F5'-GATAACTAAGTGGTGG-3'，Rep-R（SalI）5'-CGGTCGACCCAGACTTCTTGTATTTC-3'。

1.2.3 PUCm-T-CMV△Rep载体的构建及鉴定 回收CMV△Rep基因片段，与PUCm-T载体相连接，转化感受态细胞DH5a，涂布于含有Amp的平板上，随即挑取单菌落，37℃振荡培养，PCR检测并测序[3]。

1.2.4 pBIN438-CMV△Rep载体的构建及鉴定 利用BamHⅠ和SalⅠ双酶切PUCm-T-CMV△Rep和pBIN438，PUCm-T-CMV△Rep酶切基因用琼脂糖凝胶回收，T 4DNA连接酶过夜，再转化感受态细胞DH5a，在抗Amp的培养基平板上筛选阳性克隆菌落，并用PCR扩增鉴定，获得植物表达载体pBIN438-CMV△Rep[4]。

1.2.5 重组农杆菌转化及CMV△Rep基因检测 采用CaCl2冻融法将植物表达载体pBIN438-CMV△Rep转化至根癌农杆菌LBA4404中，在筛选培养基平板上培养，获得阳性菌落，经过PCR扩增和酶切鉴定后保存[5]。

2 结果和分析

2.1 CMV△Rep基因片段的PCR扩增 以pCAMBIA1302-CMV△Rep为模板，用引物Rep-F和Rep-R 扩增CMV△Rep基因后进行电泳， 获得一条约500bp的目的基因，与预期结果相符。使用凝胶回收试剂盒回收CMV△Rep基因片段。

2.2 pBIN438-CMV△Rep载体的构建及鉴定 将构建好的质粒PUCm-T-GFP测序，通过DNAstar和Oligo6软件对比，与GenBank中CMV△Rep基因序列一致。用BamHⅠ和SalⅠ对重组质粒PUCm-T-CMV△Rep进行双酶切，获得目的基因CMV△Rep，以pBIN438为基本结构，通过双酶切切开，并和CMV△Rep基因链接，获得植物表达载体pBIN438-CMV△Rep，结构图见图1。以pBIN438-CMV△Rep基因为模板，用引物Rep-F和Rep-R扩增CMV△Rep基因后进行电泳，结果显示扩增出一条500bp左右的基因片段。

图1 pBIN438-CMV△Rep表达载体结构

2.3 根癌农杆菌LBA4404-pBIN438-CMV△Rep转化及鉴定 重组质粒pBIN438-CMV△Rep导入根癌农杆菌LBA4404，平板培养，对阳性克隆菌落进行PCR检测，重组的农杆菌LBA4404-pBIN438-CMV△Rep可以扩增出约500bp的基因片段。通过提取质粒，再用BamHⅠ和 SalⅠ对重组质粒pBIN438-CMV△Rep进行双酶切，通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定双酶切后的CMV△Rep基因片段，电泳结果显示重组质粒可以被切成2个片段，大片段大于2 000bp，小片段为CMV△Rep约为500bp，结果见图2。说明载体pBIN438-CMV△Rep已经成功的转入到根癌农杆菌LBA4404中。

图2 质粒pBIN438-CMV△Rep的双酶切鉴定

3 讨论

植物病毒是造成作物减产的重要原因，传统的育种抗病、农药、脱毒等方法对于病毒的治理不仅耗时而且污染环境，近年来发现的基因沉默被证明能很好的抗相关病毒的侵染。植物抗病毒基因工程广泛采用基于病毒复制酶基因的抗病策略，复制酶基因介导的抗病性具有抗病性强的特点，是解决植物病毒病害的有效方法，已经在生产实际中取得较好的效果。本文是在此基础上，构建含有这种病毒复制酶的植物表达载体，拟用于今后进一步对神农香菊的遗传转化，希望通过沉默基因的转化来培育出具有抗黄瓜花叶病毒的转基因植株，从根本上解决危害神农香菊的黄瓜花叶病毒病害问题。

参考文献

[1]Ding S W， Anderson B J， Haase H R， et al. New overlapping gene encoded by the cucumbermosaic virus genome[J]. Virology，1994，198：593-601.

[2]牛颜冰，青玲，周雪平.RNA沉默机制及其抗病毒应用[J].中国生物工程杂志，2004，24（2）：76-79.

[3]张响玲，张延龙， 牛立新，等. 岷江百合中黄瓜花叶病毒诱导的LrPR10的克隆及表达分析[J].园艺学报，2014，41（6）：1218-1226.

[4]尤佳，张宁，文义凯，等.Gry ⅢA基因植物表达载体构建及马铃薯遗传转化[J].草业学报，2014，23（1）：248-256.

[5]尚爱芹，田传卫，赵梁军，等.Z根癌农杆菌介导北海道黄杨遗传转化体系的建立[J].园艺学报，2008，35（3）：409-414.

（责编：张长青）