Noggin基因修饰对Aβ致伤神经干细胞凋亡及突触素表达的影响①

王增冕,张晓梅,盛宝英

(佳木斯大学附属第一医院神经内科,黑龙江 佳木斯 154003)

Noggin基因修饰对Aβ致伤神经干细胞凋亡及突触素表达的影响①

王增冕,张晓梅,盛宝英

(佳木斯大学附属第一医院神经内科,黑龙江 佳木斯 154003)

noggin基因;P38表达;神经干细胞

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)R 病人群大多数为中老年人。此病患者经常记不清发生的事情，认不出熟悉的人，而且在行为神态上呈现出呆傻状态。这主要是因为病人的中枢神经受到此病的侵害，中枢神经不能正常工作。年龄越大的人患病的可能性越大。因此，由该病引起的死亡排在临床死亡原因的第四位。此类疾病的病理是：病患的神经细胞遭到破坏，影响病患的部分身体机能的工作。治疗该病的关键在于病变神经元的恢复和替换。婴儿和成年人的大脑内都有神经干细胞。利用神经干细胞移植入受损的神经组织，更换和修复受损的神经元，以恢复大脑的正常功能，是用于AD的治疗未来的一个重要方向。神经系统的神经干细胞不仅在发展中国家，也继续存在于成人中枢神经系统中的多个脑区域。利用神经干细胞移植入受损的神经组织，更换和修复受损的神经元，以恢复大脑的正常功能，是用于AD的治疗未来的一个重要方向。

1 材料与方法

1.1 实验材料

新生3d内昆明小鼠 由佳木斯大学实验动物中心提供。

1.2 主要试剂配制

①2μg/mL bFGF 液配制:bFGF100ug加5mL三蒸水配制成20μg/mL bFGF 溶液(-20℃冰冻)。1mL的20μg/mL bFGF 溶液加9mL三蒸水配制成2μg/mL bFGF 溶液。

②2μg/mL EGF 液配制:EGF100μg加5mL三蒸水配制成20μg/mL EGF 溶液(-20℃冰冻)。1mL的20μg/mL EGF 溶液加9mL三蒸水配制成2μg/mL EGF溶液。

③DMEN/F12(1:l)培养基二倍液配制:取DMEM/F12干粉14.79g，三蒸水400mL溶解，NaCHO3调整pH值7.2～7.4，定容至500mL。0.22μm微孔滤膜滤器过滤，每瓶50mL/瓶分装。-20℃保存。用时37℃温箱孵育。

④神经干细胞培养基配制:试剂液体量加入后浓度,DMEM/F12 二倍液50mL —EGF(2μg/mL)1mL 20ng/mL;bFGF(2μg/mL)1mL 20ng/mL;B27 2mL 2%;青霉素(1万单位/mL)1mL 100单位/mL;链霉素(1万单位/mL)1mL 100单位/mL;用10%NaHCO3或HCL调节pH 值为7.2～7.3。三蒸水滴定容至100mL，密闭，4℃冰箱保存备用。

⑤多聚赖氨酸的配制:将多聚赖氨酸以1：10的比例稀释于无菌三蒸水中，针式滤器过滤，盛装于塑料瓶内备用。应用时将多聚赖氨酸均匀涂布于盖玻片上，无菌培养箱孵育过夜，灭菌三蒸水清洗2次，将盖玻片置入无菌培养板孔中，晾干后使用。

⑥Aβ1-42 聚集态的制备:用二甲基亚砜溶解Aβ1-42后加0.01MPBS 使其终浓度12.5μmol/L， 37℃培养箱中孵育一周(二甲基亚砜浓度小于5%)。

1.3 实验方法[1～4]

1.3.1 小鼠海马神经干细胞分离、培养

75%酒精的棉球擦洗新生小鼠，在超净工作台无菌条件下断头并分离海马，无菌眼科剪将组织块剪成1mm3以下的小块，用尖头已抛光的长颈吸管机械吹打成单细胞悬液，用血球计数板计数，以5×106/L密度接种于培养瓶中，神经干细胞条件培养基，37℃、CO2体积分数5%的条件下培养，每3天换一半完全培养液。

1.3.2 神经干细胞的传代培养及分化

在培养的第7～10天，用15mL离心管收集培养瓶中的多克隆球，1000rpm离心3min，弃上清。用尖头已抛光的长颈吸管吹打成单细胞悬液，传代次数共计不超过4次。以1×106/L 密度接种于多个25cm2的培养瓶中，加入神经干细胞完全培养液，以后每3～4日半量换液，6～7d传代一次。传三代后神经干细胞在培养液内加入10%胎牛血清，孵育72h后行MAP-2、GFAP鉴定。

1.3.3 SABC免疫化学法Nestin、MAP-2、GFAP鉴定

取悬浮培养第三代神经干细胞，接种于预先涂布0.1g/L多聚赖氨酸的盖玻片中，并加入分化培养基，37℃培养箱培养24h后行Nestin免疫荧光鉴定。

1.3.4 重组PEGFP-N1-NOG真核表达载体的构建

① noggin基因的提取

根据大鼠Noggin基因cDNA的全部序列, 设计一对引物，noggin上游：5’GCCAACATTATCTGCACATCAGAC3’,下游：5’TACTGAATGGTTATCCACGCACAC3’,提取胎鼠脑细胞总RNA, 合成cDNA的第一条链,取5μL RT产物进行PCR反应,总反应体系为50μL,反应条件为94℃5min后,94℃ 45s、60℃ 45s、72℃ 2min循环35次,末次延伸72℃ 10min。

② pEGFP-N1和noggin质料的准备

将含DH5α的菌株以1∶100体积比接种于LB培养基中,同时把Noggin质粒的DH5α菌株以同比例种于100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基内,37℃摇床培养12～16 h。

③pEGFP-N1和noggin的产物回收

对pEGFP-N1和Noggin质粒酶切产物电泳目的进行回收。

④ DNA的片段连接

将回收纯化基因片段Noggin和pEGFP-N1进行定向连接。

⑤ pEGFP-N1-NOG重组质粒的双酶切鉴定。

大肠杆菌DH5α的制备扩连接产物的转化均在无菌条件下操作。从含kan的平板上随机挑取3～4个菌落分别接种于5mL含有30μg/mL Kan 的LB液培养基中，37℃，180r/min振荡培养10～12h后，提取质粒。所提取的质粒用限制性内切酶EcoR I和Sal I双酶切鉴定。重组质粒的PCR扩增鉴定:采用20μL体系进行PCR，产物经1%琼脂糖凝胶电泳，pEGFP-N1-NOG引物序列对应目的片段长7599bp，用Marker DL 15000作为参照。

pEGFP-N1-NOG的DH5α阳性克隆菌液中加入15%甘油，-70℃保存备用。

1.3.5 重组PEGFP-N1-NOG基因转染大鼠神经干细胞及Noggin蛋白表达

瞬时转染24h后，按1/10比例传代，第二天改用含G418 (800UG/ML)及10%胎牛血清的MEM培养液筛选，维持培养，3～5d换液一次，约7d左右阴性对照细胞全部死亡，将G418浓度降为200μg/mL的维持浓度，约14d后出现细胞克隆。挑取阳性克隆扩大培养，命名为NSC/NOGGIN载体组和NSC/空载体组，分别扩大培养，传代建系。激光共聚焦显微镜检测重组PEGFP-N1-NO。

1.3.6 实验分组

正常组：神经干细胞不加β-淀粉样蛋白培养；Aβ组：β-淀粉样蛋白与体外培养的未转染神经干细胞；noggin组： PEGFP-1-noggin神经干细胞β-淀粉样蛋白培养；空质粒组：β-淀粉样蛋白与转染PEGFP-1 -GFP修饰神经干细胞共培养；Noggin+Aβ组：β-淀粉样蛋白与体外培养的PEGFP-1-noggin神经干细胞共培养。

1.4 统计学方法

采用SPSS10.0行方差检验分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

免疫组化检测结果显示：正常组Caspase-3 阳性细胞比率最低，多散在分布；Aβ组与空质粒Caspase-3 阳性细胞比率较高，达34.83%、33.96%，行χ2检验Aβ组与空质粒比较P>0.05，Aβ组及空质粒与其他组比较P<0.01。noggin+Aβ组Caspase-3 阳性细胞比率较小，达24.72%，与正常组、Aβ组与空质粒比较P<0.01，结果具有统计学意义。

3 讨论

神经干细胞的生物学特性是自我更新、多分化潜能，还有良好的迁移能力和与宿主细胞融合能力以及低免疫源性，使其为移植治疗神经系统疾病成为可能。我们可以利用神经干细胞的生物学特性。通过移植使损伤神经的结构和功能达到重建立，也可将目的基因转染至神经干细胞，使其做为基因载体，达到基因治疗及结构修复的协同作用，所以，神经干细胞的体外培养、基因转染与细胞移植，成为近年研究的热点[5～9]。有研究表明在转基因小鼠建立的 AD 模型中发现其额叶的前皮质内缺乏突触素和神经元，而AD 患者的神经元突触损伤的关键原因是Aβ的神经毒性作用，所以近年来，突触素常常做为AD研究的一个指标。本实验结果显示: 与未转染NSCs比较，noggin基因转染神经干细胞突触素表达增高，转染组细胞在Aβ致伤条件下仍可有一定的突触素表达。noggin基因在常规体外培养条件下，可提高NSCs的突触素表达，有利于细胞间的信号传递，在Aβ 致伤后noggin基因仍可促进突触素的表达，提示在轴突的生长和突触的成熟中，noggin基因可能起到重要作用。利用神经干细胞移植与原位诱导治疗中枢神经系统退行性疾病一直是人们不断探索的一种手段，希望找寻补偿各种原因引起的神经元丢失的方法，以促进脑缺血后神经功能的恢复。noggin基因转染在一定程度上能抑制体外培养的神经干细胞在Aβ致伤后的凋亡，提高体外培养及Aβ 致伤条件下突起生长、突触素表达，但其作用机制还需进一步探讨，noggin基因修饰神经干细胞移植治疗AD，对促进原位细胞的生长发育、神经再生以及退行性病变的神经系统中的突触重建所能起的作用还需进一步观察。

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黑龙江省教育厅科研项目, 编号: 12521543。

王增冕(1985～)女，黑龙江佳木斯人，硕士，医师。

盛宝英(1956～)女，黑龙江佳木斯人，硕士，主任医师，硕士研究生导师。E-mail:dr.wts@163.com。

Q421

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1008-0104(2015)01-0157-02

2014-05-03)