铜尾矿恢复植物白三叶抗叶斑病反应中防御酶活性变化

李 晶，查美玲，汪徐春

(1.蚌埠医学院 生物科学系，安徽 蚌埠 233030；2.安徽师范大学 生命科学学院，安徽 芜湖 241000)

【现代应用技术研究】

铜尾矿恢复植物白三叶抗叶斑病反应中防御酶活性变化

李 晶1,2，查美玲1，汪徐春1

(1.蚌埠医学院 生物科学系，安徽 蚌埠 233030；2.安徽师范大学 生命科学学院，安徽 芜湖 241000)

通过盆栽实验研究了链格孢菌对铜尾矿复垦植物白三叶草的致病力及叶片抗病性相关酶活性的影响.结果表明，链格孢菌对源自铜尾矿区的白三叶草有一定的致病力但感病指数不高.与不接种对照组相比，接种组叶片的多酚氧化酶、过氧化物酶及苯丙氨酸解氨酶活性升高，差异性显著.随着染病时间延长，三种防御酶活性均是先升高后降低.多酚氧化酶活性在接种5天达到高峰，过氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶活性均在接种7天达到最高峰.

复垦植物；抗病性；酶活性

自然界中，病原菌与寄主植物的相互作用一直广泛存在着，并是研究的热点之一.研究表明，病原菌感染寄主植物以后，植物个体的生长、组织结构、生理生化特性等方面均会发生变化，比如生长缓慢、叶片变黄、一些次生产物(如植保素)合成、植物细胞壁加强或修饰(如木质素累积)以及一些与抗病性相关的酶活性发生显著变化等.在植物体内，多酚氧化酶、过氧化物酶以及苯丙氨酸解氨酶是与抵抗病原微生物侵染相关的防御酶[1]，其活性水平可作为植物抗病性的生理指标.[2-5]

安徽铜陵铜尾矿场的复垦植物中，豆科的白三叶草(Trifoliumrepens)为优势种之一.[6]野外调查发现，作为复垦植物的白三叶草种群中有叶斑病发生，经采样分离鉴定病原菌为链格孢菌 (Alternariatenuis).有研究结果表明，在环境压力下，病原菌对植物的伤害程度加重[7-8]，然而铜尾矿生长的白三叶草虽有叶斑病发生，仍能生长，并未受到致命性伤害.为探讨重金属污染土壤上生长的白三叶草对叶斑病抗病能力、链格孢菌对白三叶草的致病力以及叶斑病是否影响到白三叶草对铜尾矿的复垦作用这些问题，本文选取铜尾矿复垦植物白三叶草进行接种链格孢菌实验，研究病原菌对白三叶草致病力以及植物受病原菌侵染后叶片抗病性防御酶变化规律.为研究白三叶草对链格孢菌的防病战略、抗性机制提供依据，同时为重金属尾矿区复垦植物抗病遗传育种提供参考.

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试植物

寄主植物白三叶取自健康、长势好的同一个无性系，来源地为铜陵狮子山尾矿地，采样选取生物量、株高基本相同的植物幼苗.实验前剪取3叶期、长4cm匍匐茎盆栽培养40天后接种.

1.1.2 供试菌种

病原菌为链格孢菌，从上述样地染病白三叶叶片病斑上分离纯化而得.

1.1.3 供试土壤

以蚌埠医学院周边农田土为供试土壤，土壤pH为7.28，有机质含量为13.90g/kg，总氮、总磷、总钾含量分别为0.51g/kg、3.67g/kg、3.36g/kg，电导率为136.52μs/cm.

1.2 实验设计

供试土壤风干后过2mm筛，每盆称重2kg土壤装进花盆，共10盆.将剪取的上述长4cm的白三叶匍匐茎种入花盆，每盆10株，培养40天.接种链格孢菌分生孢子悬浮液到3叶期植物叶片，方法采用针刺法，同时接种无菌水作对照[9].接种后用塑料袋将接种叶片套袋保湿24 小时.分别隔离培养，并分别于接种前(0天),接种后3天、5天、7天和9天取样，测定各指标变化情况，重复3次.

1.3 测试指标和方法

1.3.1 链格孢菌对白三叶的致病力测定

接种后按表现型记载标准分4级，计算感病指数(见表1)[10].

表1 白三叶草叶斑病分级标准

1.3.2 多酚氧化酶活性测定

采用比色法[11]，以每分钟内OD410值变化0.01为一个酶活性单位(U/gFW·min).

1.3.3 过氧化物酶活性测定

以1g植物在1min内氧化愈创木酚的微克数为一个酶活性单位[12](U/gFW·min).

1.3.4 苯丙氨酸解氨酶活性测定

以1g鲜重每小时OD290值变化0.01为一个酶活性单位[13](U/gFW·h).

2 结果与分析

2.1 链格孢菌对白三叶的致病力测定

由表2可知，接种无菌水对照组的植物感病指数为0，而链格孢菌处理组的感病指数均大于0，证明供试链格孢菌菌株对白三叶有一定的致病力.但染病指数随着接种时间变化不明显，并且接种9天后染病指数刚超过50%，这表明，链格孢菌虽然可以侵染白三叶，但是不对其生长造成致命性伤害，这与野外调查发现铜尾矿复垦植物白三叶虽然受到病原菌侵染，但仍能正常生长的结果一致.说明铜尾矿区白三叶有良好的抵抗链格孢菌的能力.

表2 链格孢菌对白三叶的感病指数

2.2 链格孢菌对白三叶多酚氧化酶活性的影响

如图1，未接种组白三叶叶片多酚氧化酶活性在实验期略有变化但不明显，接种链格孢菌后，白三叶的多酚氧化酶活性有明显增加，3 天后明显升高，到第5 天为最大值，为不接种对照的2.92倍，两者之间呈极显著差异，p值小于0.01，随后酶活性下降的趋势相对缓慢.

图1 链格孢菌对白三叶叶片多酚氧化酶活性的影响

图2 链格孢菌对白三叶叶片过氧化物酶活性的影响

2.3 链格孢菌对白三叶过氧化物酶活性的影响

从图2可以看出，与对照组相比，接种链格孢菌后，白三叶叶片的过氧化物酶活性都显著增加，接种3天、5天活性升高速度较快，幅度较大，之后活性仍继续升高，但速度较缓慢，到第7天达到最高峰，是接种之前的2.14倍，随后略下降.接种第9天，过氧化物酶活性是未接种组的1.83倍.

图3 链格孢菌对白三叶叶片苯丙氨酸解氨酶活性的影响

2.4 链格孢菌对白三叶苯丙氨酸解氨酶活性的影响

如图3，在整个实验周期内，没有染病组的白三叶叶片中，苯丙氨酸解氨酶活性相对平稳，没有显著差异.而在受到链格孢菌感染以后，接种组的苯丙氨酸解氨酶活性迅速增加，到第7天达峰值，较对照组增加了175%，随后下降，第9天仍高于对照组111%.

3 讨论

感病指数可以反映病原菌对寄主植物的致病力.实验中，接种链格孢菌处理组的感病指数均大于0，证明供试链格孢菌菌株对白三叶有一定的致病力.一般来说，感病指数随着患病时间延长会增加，但是本实验中整个感病期变化不明显，接种9天后感病指数刚超过50%，这表明：链格孢菌虽然可以侵染白三叶，但并不对其生长造成致命性影响，这与野外调查发现铜尾矿复垦植物白三叶虽然受到病原菌侵染，仍能正常生长的结果一致，因此，来源于铜尾矿区白三叶有着良好的抵抗链格孢菌叶斑病的能力.

植物体内，酚类氧化物和木质素的形成可以增强植物细胞壁、形成保护屏障，以抵御病原微生物伤害，醌类及衍生物对病原微生物毒性强，能直接产生抗病作用[14].多酚氧化酶，不仅是在一些酚类氧化物和木质素的产生过程中起到催化作用的酶类，还能进一步氧化酚类物质成醌类,大量研究表明，病原菌感染可引起植物体内多酚氧化酶活性升高[15-17].本实验结果显示，在受到病原菌感染后，接种组的叶片多酚氧化酶活性在开始时增加迅速，且增加数值大，接种后5天内快速增加到最大值后开始缓慢下降.这种变化揭示，白三叶在链格孢菌感染后，多酚氧化酶活性快速增加，使得抵抗病原菌的酚类物质、木质素和醌类物质快速大量产生，从而可以通过增加机械屏障直接产生毒害作用来阻挡入侵的病原菌的伤害与扩散,寄主植物表现出对叶斑病的抗病性.

本实验结果显示，感染链格孢菌的实验组中，白三叶草叶片的过氧化物酶活性较不接种组增加.试验周期内，染病天数增加，酶活性也随之增加.过氧化物酶在植物体内，对于合成植保素、木质素和氧化酚类物质的过程中起重要作用，同时，它也是植物体内的活性氧清除剂[17].因为植物在受到病原微生物感染后，体内可以形成大量活性氧，而过氧化物酶增加可以帮助清除这些活性氧，从而保护植物免受其伤害.同时，过氧化物酶活性增加后，还能直接促进植保素、木质素合成过程，抵抗链格孢菌侵染和扩散，增加抗病能力.

在植物抗病反应中，苯丙烷类代谢可形成植保素、木质素和酚类化合物等多种抗病次生物质，是重要的代谢途径，而苯丙氨酸解氨酶是这一途径的关键酶和限速酶，受多种因素(病原物侵染、旱、冷及其他逆境等)诱导调控[3].许多研究表明，植物受病原菌侵染后，苯丙氨酸解氨酶活性会升高[4,18-20].实验结果显示，链格孢菌侵染后，白三叶草叶片苯丙氨酸解氨酶活性显著增加，表明植物体快速开启一系列苯丙烷类的反应，加速植保素和木质素大量合成来抵御病菌，表现出抗病性.

病原菌侵染后植物叶片防御酶活性与抗病性关系的报道大多认为，多酚氧化酶、过氧化物酶以及苯丙氨酸解氨酶这三种酶在植物受病原菌侵染后活性升高，并与抗病性成正相关，可以将其作为衡量植株抗病性生理指标[18-20].本实验结果显示，接种后多酚氧化酶、过氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶三种酶活性均升高，出现的高峰时间略有不同，多酚氧化酶的高峰出现在第5天，过氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶均在第7天出现高峰.因此，在白三叶感染链格孢菌后，不能简单地认为上述三种酶在任何发病时期都可以作为抗病性指标，还要综合考虑发病的时间来确定.

综上，链格孢菌对白三叶有一定的致病力，侵染后使白三叶体内与抗病相关的酶如多酚氧化酶、过氧化物酶以及苯丙氨酸解氨酶三种酶活性升高，促使了木质素、植保素等保护性物质的合成，提高了白三叶对链格孢菌的抗病性.

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【责任编辑 马小侠】

Changes of Related Defense Enzyme Activity in Resistance to the Leaf Spot Disease of a Reclamation Plant in Copper Tailing

LI Jing1, 2, ZHA Mei-ling1, WANG Xu-chun1

(1. Department of Life Sciences, Bengbu Medical College, Bengbu 233030, China; 2. College of Life Sciences, Anhui Normal University, Wuhu, 241000, China)

Through pot cultivation experiments, the effects ofA.tenuison changes of related defense enzyme activity in resistance to the leaf spot disease of white clover, a reclamation plant in copper tailing, were studied. The results showed thatA.tenuishas some virulence to white clover but susceptible index is not high. Compared with the non-inoculated control group, polyphenol oxidases, peroxidase and phenylalanin ammonia-lyase activity of white clover leaves in inoculated group significantly increased. With prolonged illness, activity of the three enzyme and lignin content firstly increased and then decreased. Polyphenol oxidase activity peaked at 5 d, peroxidase and phenylalanin ammonia-lyase activity were reached the peak at 7 d.

reclamation plant; resistance; enzyme activities

2014-04-13

安徽高校省级自然科学研究项目：安徽铜陵药用植物凤丹种植区土壤及药材中重金属含量及其健康风险初步评价(KJ2013Z208)；蚌埠医学院科研项目：重金属铜污染土壤复垦植物白三叶草的抗病性机制研究(Byky1207)

李晶(1981—)，女，江苏扬州人，蚌埠医学院生物科学系讲师，安徽师范大学生命科学学院博士研究生，主要从事生态学和天然药物研究.

S

A

1009-5128(2015)10-0030-05