脑源性神经营养因子前体对海马神经元发育的影响

李晓婷

摘 要：目的：通过体外培养海马神经元，给予抗proBDNF血清，观察其对体外海马神经元发育及存活的影响。方法：取新生0～1h的SD大鼠海马组织，体外培养神经元，给予抗proBDNF羊血清处理进行形态学观察，通过细胞免疫组织化学方法观察。结果：体外培养的海马神经元生长有明显的阶段性。给予抗proBDNF处理后，其表达量与神经元生长状态、存活细胞数成正比。培养1d组的表达水平高于3d、7d组，差值具有统计学意义。结论：给予外源性抗proBDNF羊血清处理后，体外培养的海马神经元生长状态良好且突起数目增多，提示内源性的proBDNF抑制神经元的发育，促进凋亡，给予外源性抗体后，减弱其生物学作用，神经元发育抑制因素减弱，存活细胞数、突起数增多。

关键词：海马神经元 proBDNF p75NTR sortilin

中图分类号：R651 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2015）05（b）-0241-02

神经元的发育对神经网络的形成及信号的传导等神经系统功能的执行非常关键。在神经元发育过程中，细胞的生存、生长、迁移、与其他细胞建立功能性联系，以及神经再生过程中轴突的生长等，除了受内源性程序的调控，还受到局部环境因素的影響。例如脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）。

BDNF是一类多肽，通过促进神经细胞的增殖、分化及存活而影响海马的神经发生，与活动依赖性突触可塑性有关，在学习与记忆过程中发挥重要作用[1]。外源性BDNF还可以促进体外培养的新生鼠海马颗粒细胞（DGCs）的存活及分化。与体内其他蛋白质的合成和分泌一样，脑源性神经营养因子由分子量为30-35kDa的前体物质--脑源性神经营养因子前体（precursor of brain derived neurotrophic factor， proBDNF）蛋白水解而来。传统的观点认为这些神经营养因子前体是无活性的，但2001年，Lee等首次发现神经营养因子前体可以促进细胞凋亡[1]。此后进一步的研究表明，proBDNF可能有着与BDNF相反的功能，Teng等发现proBDNF能够促进体外培养的神经元凋亡。

1 方法

1.1 海马神经元的培养

取新生0-1h的SD大鼠，在细胞培养间取出两大脑半球，制成细胞悬液，静置后取上层悬液，进行计数后按照实验要求以1×105/mL密度接种于包被好的培养板或玻片上。37℃、5%CO2恒温培养箱培养。以后根据细胞的生长情况及实验要求，在倒置显微镜下观察细胞的形态和生长情况。

1.2 分组

将培养的神经元随机分为抗proBDNF羊血清处理组、羊血清对照组及正常未处理组。各组选取1d、3d、7d三个时间点进行观察（给予干预组以加干预为0d计算）。

1.3 神经元鉴定

选取3d的细胞进行鉴定，倒置相差显微镜下观察、拍照、计数。根据公式计算出神经元纯度：[NeuN阳性细胞数/着色细胞数（总细胞数）]×100%=神经元阳性率（即神经元纯度）。

1.4 数据收集

根据实验要求选取不同时间点、不同条件的细胞，在倒置相差显微镜下观察。用于免疫组化的细胞显色后于镜下观察。

1.5 统计学处理

应用SPSS17.0统计软件包，数据均采用均数±标准差（x±S）表示。组内比较用t检验，组间比较用单因素方差分析。凡P<0.05，差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外培养海马神经元的生长情况

普通倒置光学显微镜下观察，接种0h，大多数细胞呈圆球型悬浮于培养基中，折光性较好，单个散在分布。接种12～24h贴壁后，神经元周围长出类似于伪足的包裹体，边界不整齐；培养3d，包裹体周围开始有一些向外生长的突起，其中一个突起较其它突起迅速生长延伸，发育成较长的轴突，其余几个短小的突起则形成树突，神经元之间逐渐形成网络；培养7d，轴突继续延伸，树突分支增多，神经元轴突和树突相互交叉、连接，形成复杂的网络。

2.2 处理组海马神经元的生长发育情况

体外培养的海马神经元，当1d组给予抗proBDNF与DMEM/F12以1：20比例稀释浓度处理时，所选取的处理组培养1d、3d、7d的细胞生长状态、存活细胞数明显多于阴性对照及正常对照组，且多突起神经元明显增多；浓度过高或过低都不利于神经元的生长。同时，当神经元形态稳定后也就是7d时给予抗proBDNF血清处理，无突起神经元出现空泡样变化。生长3d的神经元给予抗proBDNF处理后，细胞形态变化不明显，生长状态影响不大，组间差异无统计学意义。

3 讨论

3.1 新生大鼠海马神经元的体外原代培养

新生鼠与胎鼠相比，神经元分化程度高，神经突起发育成熟，神经元之间以及与纤维组织之间的连接比较紧密。而且有研究表明，通过透射电镜观察出生1d的新生大鼠海马，偶见神经元突触，且结构发育不完全、突触连接部位很短、突触小泡极少。因此为提高神经元的纯度以及存活率，我们参照原有的比较权威的培养方法，取出新生0～1h的SD大鼠海马组织，在解剖显微镜下剔除脑膜，精确定位取材，以保证组织的纯度。经机械吹打10～20次，使组织分散成单细胞悬液。以1×105/mL密度种植于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中，24h后全量换液。培养3d后，经NeuN鉴定，神经元的纯度可以达到90%以上。

3.2 proBDNF对海马神经元发育的影响

众多研究发现，在猴、大鼠的大部分脑区，如大脑皮质、海马、杏仁核、基底核、小脑、丘脑、孤束核、下丘脑、中脑、脑桥、延髓和脊髓有proBDNF表达。在胞内，proBDNF经一些酶修饰转变为BDNF，然后以BDNF的形式分泌到胞外。

同时有动物实验表明，出生后的几周内proBDNF表达水平逐渐上升，且在幼年小鼠体内proBDNF的总量要大于BDNF。小鼠海马区proBDNF水平呈动态变化，在轴突投射和突触形成过程中表达水平最高[3]。这一结果提示proBDNF在神经元发育早期有可能高表达。proBDNF作为抑制因子在脊髓损伤后神经再生过程中发挥作用。对于突触可塑性影响的研究则提示proBDNF与BDNF对突触可塑性具有双向调节作用。

在该实验中发现，在摸索给予抗proBDNF血清浓度时，相同时间点、相同接种浓度，给予不同浓度抗proBDNF血清时神经元生长状态表现各不相同，既可以表现为促进生长，也可以表现为抑制生长。从中我们选取了神经元形态变化最为明显的一组做实验分析。根据神经元素生长的五个阶段，培养7d时，轴突继续延伸，树突分支增多，神经元轴突和树突相互交叉、连接，形成复杂的网络。给予抗proBDNF血清处理后，7d时神经网络形成的较为密集，且突起分支较多。继续培养到14d、20d时，正常对照组出现悬浮细胞，干预组中出现空泡样细胞。7d后缩短换液间隔，空泡样改变未见改善。其原因未明确，因此该论文中统计分析结果所选取的时间点最长為7d。

因为该实验所给予的是外源性的干预，无法排除内源性proBDNF的影响，所以对于proBDNF对神经元发育的影响及作用机制，本实验结果无法给予明确的解答。

4 结语

给予外源性抗proBDNF羊血清处理后，体外培养的海马神经元生长状态良好且突起数目增多，提示内源性proBDNF抑制神经元的发育，促进凋亡，给予外源性抗体后，减弱其生物学作用，神经元发育抑制因素减弱，存活细胞数、突起数增多。

在神经元生长发育的晚期，因其发育已成熟，细胞处于凋亡期，内源性proBDNF表达增多，当给予相同浓度抗proBDNF羊血清处理时，无法中和内源性proBDNF的促凋亡作用，所以在培养7d的神经元基础上给予抗proBDNF羊血清干预后，表现出空泡样变化。

参考文献

[1] Junming Tan，Jiangang Shi， Gguodong Shi，et al.Changes in compressed neurons from dogs with acute and severe cauda equina constrictions following intrathecal injection of brain-derived neurotrophic factor-conjugated polymer nanoparticles[J].Neural regeneration research，2013（3）：233-243.

[2] 王圆圆，张文斌，陈静，等.大鼠海马神经元neurobasal无血清的原代培养方法[J]. 2008（6）：547-551.

[3] Yang J，Siao CJ，Nagappan G，et al. Neuronal release of proBDNF[J].Nat Neurosci，2009（2）：113-115.