低剂量γ射线对人淋巴母细胞CCNG1基因表达的影响

何颖，沈先荣，钱甜甜，王庆蓉，侯登勇，蒋定文，刘玉明，李珂娴，陈伟

3 讨 论

低剂量γ射线对人淋巴母细胞CCNG1基因表达的影响

何颖，沈先荣，钱甜甜，王庆蓉，侯登勇，蒋定文，刘玉明，李珂娴，陈伟

目的 观察低剂量γ射线对人淋巴母细胞(AHH1)细胞周期蛋白G1(CCNG1)基因表达的影响，探讨CCNG1基因用作低剂量范围辐射生物剂量计的可能性。方法 采用0、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0Gy γ射线照射AHH-1，分别于照射后4、24、48、72、168h提取细胞总RNA，采用实时荧光定量PCR法检测AHH-1中CCNG1基因的表达变化，分析该基因表达的时间及剂量效应关系。结果 γ射线照射后AHH-1中CCNG1基因表达呈剂量依赖性上调，具有较好的剂量效应关系。时间效应曲线表明，CCNG1基因表达在照射后24h达峰值，之后开始下降，至168h恢复至照射前水平。结论 CCNG1基因在低剂量范围(0～1.0Gy)具有较好的剂量效应和时间效应关系，是一种潜在的低剂量电离辐射生物剂量计。

辐射，电离；辐射剂量；AHH-1细胞；细胞周期蛋白G1；基因表达；生物剂量计

人们在空中旅行、室内有氡的居室、太空飞行或低水平的污染区域均会暴露于低水平的电离辐射[1]。国内外放射生物学家数十年来一直致力于低水平电离辐射暴露后的生物学效应研究，但目前低剂量电离辐射的危险评估依然是建立在线性无阈假说基础上的，该假说由高剂量照射外推而来，认为低剂量电离辐射的生物效应是对健康有害的[2]。但是，职业和环境低剂量电离辐射的生物效应远较线性无阈模型预测的复杂[3]，其原因主要与DNA修复的细胞反应、旁效应的细胞敏感性和延迟的基因组不稳定性有关[4]。目前，关于低水平电离辐射暴露对人体健康的影响研究较少[5]，低剂量电离辐射的风险评估具有重要的社会意义[6]，而深入了解低剂量电离辐射诱导的细胞反应、寻找低剂量电离辐射的生物标志物是进行正确评估的关键。笔者在前期研究中，采用全基因组表达谱芯片检测分析了0、0.1、0.5、1.0Gy γ射线照射4h后，人淋巴母细胞(AHH-1)基因表达变化情况，发现细胞周期蛋白G1(cyclin G1，CCNG1)基因表达随辐射剂量的增加而上调[7]。CCNG1是细胞周期蛋白家族的重要成员，是唯一受肿瘤抑制基因p53调控的细胞周期蛋白，对细胞周期进程起负调控作用，在细胞增殖、DNA修复中发挥作用，参与细胞DNA损伤后的G2/M期阻滞及细胞凋亡[8-10]。本研究选用AHH-1为研究对象，采用实时荧光定量PCR法检测CCNG1基因在不同低剂量γ射线照射后的表达水平以及剂量效应关系和时间效应关系，探讨其变化规律及作为低剂量电离辐射生物剂量计的可能性。

1 材料与方法

1.1 细胞株和试剂 AHH-1由第二军医大学防原医学教研室惠赠，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640(Gibco公司)培养基，在37℃、5%CO2培养箱中培养。Trizol试剂、M-MLV反转录酶为Invitrogen公司产品。SYBR Premix Ex Taq为TaKaRa公司产品。

1.2 照射条件 在复旦大学放射医学研究所进行照射，照射源为Gamma cell 40，137Cs(NORDION International Inc. Canada)，单次照射，照射剂量分别为0、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0Gy(照射剂量率0.162Gy/min)，每个剂量设3个平行样品。

1.3 总RNA抽提及cDNA合成 照射后细胞置于37℃、5%CO2孵箱中继续培养0、4、24、48、72、168h，随后每组样品取1×106个细胞，加1ml Trizol裂解细胞，提取总RNA，测定RNA浓度和纯度，然后行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性。采用Invitrogen公司的M-MLV反转录酶对抽提的AHH-1总RNA进行cDNA反转录合成，反转录总体积为20µl，总RNA为1µg，引物为Oligo(dT)18，具体操作按照产品说明书进行。

1.4 引物设计 根据NCBI数据库中的β-actin和CCNG1基因序列，采用Primer Premier 5软件设计实时荧光定量PCR的相应引物，具体序列见表1。引物由上海捷瑞生物工程有限公司(GENEray)合成。

表1 扩增基因的引物序列Tab. 1 Primer sequence of amplifiable genes

1.5 实时荧光定量PCR 采用SYBR实时荧光定量PCR法，PCR反应程序为：95℃ 3min，95℃ 10s，60℃ 30s，共40个循环。每个样品重复做3个平行样，每次反应结束后进行熔解曲线分析，排除非特异性PCR产物的影响。以β-actin为内参，同时设置空白对照组。结果以2–ΔΔCt表示，变化倍数2倍以上认为有显著差异。

1.6 统计学处理 采用MJ Option Monitor Analysis Software V3.1和Excel软件的线性回归分析法对结果进行分析。

2 结 果

2.1 PCR扩增产物特异性验证 2%琼脂糖凝胶电泳结果显示，β-actin和CCNG1基因的PCR扩增产物特异性好，大小与理论值吻合(图1A)。熔解曲线分析显示β-actin和CCNG1基因均为单峰(图1B)。表明上述基因扩增均为特异性扩增。

2.2 低剂量γ射线照射后AHH-1中CCNG1 mRNA表达的时间效应 PCR结果显示，不同剂量137Cs γ射线照射后，AHH-1细胞中CCNG1 mRNA的表达变化趋势一致，即随时间推移，CCNG1 mRNA表达水平不断增高，在24h时达到峰值，随后开始逐渐降低，72h时已接近照射前水平。时间效应曲线见图2。

图1 PCR反应特异性扩增Fig. 1 Specific amplification of PCR reaction

2.3 低剂量γ射线照射后AHH-1中CCNG1 mRNA表达的剂量效应 不同剂量137Cs γ射线照射后，AHH-1中CCNG1 mRNA的表达水平随剂量的增加而增加。照射后24h，0.1Gy照射组表达水平为0Gy组的2.01倍，而0.2Gy照射组为2.35倍，0.5Gy照射组为3.16倍，0.8Gy照射组为3.51倍，1.0Gy照射组为4.32倍，拟合量效关系回归曲线方程为y=2.8205x+1.5028，R2=0.9274(图3)。照射后48h，0.1Gy照射组表达水平为0Gy组的1.66倍，而0.2Gy照射组为2.11倍，0.5Gy照射组为2.41倍，0.8Gy照射组为2.78倍，1.0Gy照射组为3.32倍，拟合量效关系回归曲线方程为y=1.941x+1.373，R²=0.911(图4)。

图2 不同剂量γ射线照射后CCNG1 mRNA表达变化的时间效应曲线Fig. 2 Time-effect curve of CCNG1 mRNA expression after irradiation with 0-1.0 Gy γ-rays

图3 照射后24h时CCNG1 mRNA表达的剂量-效应曲线Fig. 3 The dose-effect curve of CCNG1 mRNA expression at 24h post-irradiation

图4 照射后48h时CCNG1 mRNA表达的剂量-效应曲线Fig. 4 The dose-effect curve of CCNG1 mRNA expression at 48h post-irradiation

3 讨 论

某些基因的表达水平在电离辐射后会发生改变，有可能作为生物标志物用于受照剂量的估算。目前国内外已有众多相关研究，但关于低剂量电离辐射后的转录水平呈剂量依赖性改变的基因鲜见报道。

CCNG1是最早发现的p53靶基因之一，是p53-Mdm2网络中的关键调控因子。有研究报道CCNG1在毛细血管扩张性共济失调症突变(ataxiatelangiectasia mutated，ATM)依赖的p53调控和DNA损伤时的细胞周期调节中具有重要作用，认为CCNG1缺乏可增加p53的聚集，使p53在Ser-15位点发生磷酸化，进而导致细胞周期阻滞，而CCNG1介导的p53调控依赖于ATM蛋白的状态，CCNG1异位表达可显著减少DNA损伤时含有ATM的正常人皮肤成纤维细胞稳定态p53和Ser-15位点的p53磷酸化[11]。Seo等[12]报道CCNG1可通过上调细胞周期蛋白B1(cyclin B1)对抗电离辐射诱导的G2期阻滞，进而增加细胞的辐射敏感性。常公民等[13]采用3.0Gy中子照射小鼠，发现小鼠骨髓细胞CCNG1基因表达明显上调，认为CCNG1可能是中子辐射致骨髓损伤的敏感靶基因之一。

本研究采用实时荧光定量PCR法定量分析0.1～1.0Gy低剂量γ射线照射后CCNG1 mRNA表达水平的剂量效应关系以及时间效应关系，结果发现，AHH-1中CCNG1 mRNA表达水平随剂量的增加而增加，不同剂量照射后CCNG1 mRNA表达水平随时间变化的趋势一致，即照射后24h表达最高，随后逐渐下降，72h时恢复正常。在照射后24h和48h，CCNG1 mRNA表达水平与受照剂量呈线性关系，并具有较好的重复性。

Kabacik等[14]为了寻找一组适合用于生物剂量计的基因，采用芯片技术、多重实时定量PCR(multiplex quantitative real-time polymerase chain reaction，MQRT-PCR)和nCounter分析系统，对2.0Gy或4.0Gy X线照射后的离体人淋巴细胞和外周血白细胞的辐射反应基因进行检测，结果发现数个基因适合用作生物剂量计，其中包括了CCNG1基因。Filiano等[15]检测了0～8Gy剂量照射后CCNG1基因表达随剂量和时间变化的规律，认为CCNG1基因与其他基因可以联合应用于电离辐射的生物剂量定量评估。Manning等[16]对受p53介导的DNA损伤反应调节的13个生物标志物在高剂量(0.5～4Gy)和低剂量(5～100mGy)照射2h和24h后的转录水平进行了检测，结果显示低剂量电离辐射反应基因CCNG1与其他2个基因(FDXR和DDB2)联合应用于100mGy暴露时的剂量评估值为98mGy，认为这些基因可用作低剂量电离辐射暴露的生物标记物。结合本研究结果，我们认为CCNG1基因对电离辐射敏感，在低剂量范围内存在较好的剂量效应关系和重复性，有可能作为一个新的生物标志物，单独或与其他基因联合应用于低剂量电离辐射暴露人员的受照剂量估算。

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Effects of low-dose γ-ray on the expression of CCNG1 gene in human lymphoblasts

HE Ying, SHEN Xian-rong*, QIAN Tian-tian, WANG Qing-rong, HOU Deng-yong, JIANG Ding-wen, LIU Yu-ming, LI Ke-xian, CHEN Wei

Naval Medical Research Institute of PLA, Shanghai 200433, China

*Corresponding author, E-mail: xianrong_sh@163.com
This work was supported by the Science Technology Program of the General Logistics Department of PLA (AHJ09J012)

ObjectiveTo investigate the effects of low dose γ-ray on the gene expression of cyclin G1 (CCNG1) in human lymphoblasts AHH-1 line and the probability of CCNG1 as bio-dosimeter for low-dose radiation.MethodsLymphoblasts of AHH-1 line were irradiated with γ-ray in the doses of 0, 0.1, 0.2, 0.5, 0.8 or 1.0 Gy. Total RNA of cells was extracted at 0, 4, 24, 48, 72 and 168h after irradiation, and real-time Q-PCR was used to detect the expression of CCNG1 gene in AHH-1 cells. The relationship between the irradiation dosage or duration and the gene expression was analyzed.ResultsThe gene expression of CCNG1 in AHH-1 cells increased in a dose-dependent manner after irradiation, presenting a better dose-effect relationship. Time-effect curve indicated that the peak expression of CCNG1 appeared at 24h after irradiation, and then the expression decreased gradually with time, and it recovered to the level before irradiation at 168h after irradiation.ConclusionsCCNG1 gene is sensitive to low dose irradiation (0-1.0Gy) with a better dose and time-effect relationship, and it may be used as a potential efficient biological dosimetry in low dose exposure risk assessment.

radiation, ionizing; radiation dosage; AHH-1 cells; cyclin G1; gene expression; biological dosimeter

R811.5；R148

A

0577-7402(2015)06-0498-04

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.06.16

2014-11-29；

2015-01-23)

(责任编辑：李恩江)

全军后勤科研计划项目(AHJ09J012)

何颖，理学博士。主要从事辐射生物效应与医学防护方面的研究

200433 上海 海军医学研究所(何颖、沈先荣、钱甜甜、王庆蓉、侯登勇、蒋定文、刘玉明、李珂娴、陈伟)

沈先荣，E-mail：xianrong_sh@163.com