青萍生长抑制试验对稀脉浮萍的适用性研究

梁艺怀，张琨，张京佶，刘敏，赵华清，殷浩文

上海市检测中心 生物与安全检测实验室，上海 201203

青萍生长抑制试验对稀脉浮萍的适用性研究

梁艺怀，张琨，张京佶，刘敏，赵华清，殷浩文*

上海市检测中心 生物与安全检测实验室，上海 201203

为了验证我国本土常见的稀脉浮萍(Lemna aequinoctialis)是否适用于以青萍(Lemna minor)作为标准试验生物的生长抑制试验，对两种浮萍的毒性效应终点和毒性响应差异进行比较。通过对两种浮萍的总叶面积、干重、鲜重同叶状体数之间的相关性进行分析，根据《OECD化学品测试准则No. 221浮萍生长抑制试验》，遵从良好实验室规范(GLP)，将两种浮萍暴露于参比物质3,5-二氯苯酚，进行7 d更新式毒性试验，暴露浓度为(1.0～10) mg·L-1。结果表明，青萍的培养条件、试验方法以及毒性效应终点均适用于稀脉浮萍，两种浮萍的毒性试验呈现出相似的时间-效应关系和剂量-效应关系，两者的毒性效应浓度具有可比性，且数值上接近。以上实验结果可以得出，稀脉浮萍适用于生长抑制试验；鉴于稀脉浮萍在我国分布广泛、容易获取，稀脉浮萍可作为毒性测试的国家标准试验生物。

3,5-二氯苯酚；稀脉浮萍；青萍；生长抑郁；叶状体数；总叶面积

化学品的植物毒性鉴别和评价是生态风险评价的一个基本组成部分。一些工业化国家和国际组织将其作为化学品管理的一项基本信息，并制定了相应的法规和标准方法[1-4]。植物毒性评价可利用藻类、水生维管束植物和陆生维管束植物。进入环境中的化学物质最终都会汇入水生生态系统中，因此，水生植物的毒性评价特别关键[5]。

水生维管束植物是很多水生生态系统中初级生产者的重要组成部分，它们不仅是是化学物质沉积、迁移和激活(生物有效化)的重要通道，也是水生生态系统受污染物威胁的重要指示者。到目前为止，最常用于毒性评价的维管束植物是浮萍，它们属于单子叶植物纲的浮萍科(Lemnaceae)，是一类种子植物，生物学上分类地位比较高等[6,7]。浮萍兼有种子和分株两种繁殖方式，种子繁殖表明其在植物界中具有高等植物的特征，而分株繁殖使其数量能在短时间内快速扩增，非常适于作为试验生物。

目前，已经积累了大量以浮萍科植物作为实验材料的研究资料。尤其是在环境基准研究和化学品安全管理中，青萍(Lemna minor)和圆瘤浮萍(Lemna gibba)已在许多国家成为法定的植物毒性测试的标准物种[3,4]。在我国，虽然已有不少研究者利用浮萍从事化学品和污染物的毒性评价[8-16]，但关于浮萍测试技术标准化方面的工作还有所欠缺，尚未深入开展本土种属适宜性的验证工作。本研究首次对我国常见的稀脉浮萍(Lemna aequinoctialis)与标准试验生物青萍(L. minor)进行效应终点以及参比物质3,5-二氯苯酚毒性响应差异的比较分析，为毒性测试方法的国家标准制定提供依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 仪器与试剂

仪器：超高效液相色谱仪(Waters AcquityTMH-class，美国Waters公司)，光照恒温培养箱(HZQ-311C，上海一恒科技有限公司)，pH计(HI98128，美国HANNA instruments)，电子分析天平(AL204，瑞士Mettler-Toledo)，照度计(LX100，法国KIMO)，体视显微镜(Motic K series，Motic Images Plus 2.0，厦门，麦克奥迪公司)。

试剂：3,5-二氯苯酚(99.9%，Sigma-Aldrich，批号MKBH6101V)。

1.2 受试生物

本研究所用浮萍采自野外，由上海野生动植物鉴定中心认定为青萍和稀脉浮萍，见图1。将刚采集的浮萍置于清水中振荡，除去表观易见的污染物，用0.5%的NaClO溶液灭菌约20 s后，去离子水漂洗3次，置于灭菌容器中，用Steinberg浮萍培养基在实验室条件下暂养。暂养期间，每周更换培养基两次，并定期淘汰多余的浮萍，培养8周以上才能用于试验。

1.3 毒性效应终点的相关性比较

为验证青萍的毒性测试效应终点是否适用于稀脉浮萍，将两种浮萍分别按照叶状体数9、15、21、27、33、39、45、51进行分组，每组3个平行，根据《OECD化学品测试准则No. 221浮萍生长抑制试验》[3]提供的方法依次测定总叶面积、鲜重和干重。将各组总叶面积、鲜重、干重的平均值与叶状体数进行Pearson相关分析。

图1 青萍(a)与稀脉浮萍(b)Fig. 1 L. minor (a) and L. aequinoctialis (b)

1.4 毒性响应差异比较

1.4.1 试验溶液配制和试验方式

称取一定量3,5-二氯苯酚溶解到Steinberg浮萍培养基中，配制成500 mg·L-1的母液，经过Steinberg浮萍培养基稀释成各浓度试验溶液。试验共设置5个暴露浓度组，配制浓度分别为1.0、1.8、3.2、5.6和10 mg·L-1，以及1个Steinberg培养基空白对照组。每组设3个平行，试验共进行7 d，在第4天对试验溶液进行更新。

1.4.2 浮萍预培养与接种

试验前，选择足量的青萍和稀脉浮萍在试验条件下培养7 d，保证浮萍处于指数生长期。

将试验溶液分装入灭菌的试验容器(直径100 mm、高度45 mm结晶皿)中，每皿150 mL，剩余溶液用于pH值测定。随机选择含有2～4片叶状体的健康浮萍植株(无表面损伤或变色)进行初始接种，每个试验容器中均为9片叶状体。

1.4.3 暴露条件

将试验容器用透明保鲜膜覆盖后随机放入培养箱中培养，减少不同位置光照与温度差异对试验的影响。同时，每次观测或换液后，随机放置试验容器。

试验期间，培养温度保持在(23.9～24.3)℃；容器表面保持连续光照，光照强度在(6 605～6 903) lux，光照强度变化不超过平均光照强度的±15%；对照组溶液的pH变化不超过1.5个单位。

1.4.4 观察和测定

在试验开始、溶液更新前后以及结束时测定各试验溶液的pH值，同时从各组3个平行的试验溶液中取等体积样混合后用于浓度分析。

试验开始时，在试验培养箱中放置4个仅含培养基的容器，每日测定其温度。

在试验开始后0 d、2 d、4 d和7 d对各试验容器中的浮萍叶状体数和总叶面积进行测定，并观察和记录异常情况。同时测定培养箱光照强度。

1.4.5 暴露浓度分析

用超高效液相色谱法测定试验溶液中3,5-二氯苯酚的实际浓度，方法检出限为0.0530 mg·L-1，信噪比为8.88；定量限为0.106 mg·L-1，信噪比为16.7。0.127和4.24 mg·L-1加标样品的平均回收率均为104%，精密度值分别为2.59% 和0.53%。建立样品标准曲线，线性方程为Y=1.41×104X-116，相关系数为0.9999。

1.4.6 数据处理与统计分析

计算空白对照组叶状体数的倍增时间，以确定是否满足试验有效性要求。分别计算浮萍叶状体数和总叶面积两个效应终点的平均特定生长率、生长量及其抑制率，并采用Dunnett's Test比较各浓度组与对照组之间的差异。基于各浓度组的时间加权平均值，通过毒性分析软件Toxcalc v 5.0.26处理数据，用Maximum Likelihood-Probit法估算效应浓度EC10、EC50及其95%置信限。平均特定生长率和生长量的抑制效应浓度分别以ErCx和EyCx来表示。

2 结果(Results)

2.1 毒性效应终点的相关性

两种浮萍的各效应终点间均具有近似的关系：与叶状体数的相关性中，总叶面积>干重>鲜重，即总叶面积与叶状体数的相关性最佳(表1)。

表1 青萍和稀脉浮萍的总叶面积、鲜重、干重同叶状体数的Pearson相关系数

2.2 青萍和稀脉浮萍对3,5-二氯苯酚的毒性响应

2.2.1 试验有效性

按照试验有效性的要求，对照组叶状体数的倍增时间应该小于2.5 d (60 h)，即特定生长率超过0.275 d-1，相当于7 d至少增长7倍。本研究中，青萍和稀脉浮萍对照组叶状体数的倍增时间分别为2.1 d和1.6 d，平均特定生长率分别为0.326 d-1和0.430 d-1，故试验有效。

2.2.2 暴露浓度分析

用超高效液相色谱法测定试验溶液中3,5-二氯苯酚的实际浓度。如表2所示，除了1.0 mg·L-1浓度组，其他组试验溶液中样品实际浓度在更新期间的变化未超出20%，且所有浓度组与各自实测浓度的时间加权平均值的偏离程度均在±20%之内(-12.4%～14.2%)。因此，将各浓度组实测的浓度时间加权平均值用于3,5-二氯苯酚的浓度-效应关系分析。

2.2.3 浮萍异常表征

试验结束时，两种浮萍空白对照组的颜色、形态正常。对于青萍，3.2 mg·L-1组叶状体变色、根部脱离，而5.6 与10 mg·L-1组均出现叶状体枯萎、坏死。对于稀脉浮萍，3.2、5.6 与10 mg·L-1组均出现叶状体枯萎、坏死。

2.2.4 浮萍生长抑制情况

如各浓度组浮萍在试验期间的生长曲线所示(图2)，青萍和稀脉浮萍都呈现出相似的时间-浓度-效应关系。期间，两种浮萍的空白对照组和最低浓度组(1.0 mg·L-1)的叶状体数和总叶面积均保持指数增长，而5.6与10 mg·L-1组在试验开始2 d后即未观察到生长。

表2 各浓度组试验溶液中3,5-二氯苯酚的实测浓度

注：“ND”，未检出；检出限为0.0530 mg·L-1；“/”，停止更新，未测定；“—”，不适用。

Note: “ND”, not detected; Limit of detection = 0.0530 mg·L-1; “/”, no measurement due to termination; “—”, not applicable.

图2 试验期间3,5-二氯苯酚7 d暴露对青萍(a,b)和稀脉浮萍(c,d)叶状体数及总叶面积的影响Fig. 2 Effects of 3,5-dichlorophenol on the frond numbers and total frond areas of L. minor (a,b) and L. aequinoctialis (c,d) during the seven-day test

对于两种浮萍，无论是叶状体数还是总叶面积，除了最低浓度组，其他浓度组的平均特定生长率与生长量同空白对照组相比，差异均有统计学意义(p < 0.05)。因此，在当前试验条件下，青萍与稀脉浮萍暴露于3,5-二氯苯酚7 d后的无可观察效应浓度(NOEC，生长抑制效应)值均为0.963 mg·L-1。

根据平均特定生长率的抑制率，拟合得到两种浮萍暴露于3,5-二氯苯酚7 d后的浓度-抑制效应曲线(图3)，从而获取相应的ErCx值及其95%置信限(表3)；根据生长量的抑制率，以同样的方法得到EyCx值及其95%置信限(表4)。与青萍的国际比对试验结果进行比较发现，三者在数值上接近，表明稀脉浮萍作为浮萍生长抑制试验受试物种的适宜性(表3)。另外，稀脉浮萍的ErCx值与EyCx值均比青萍低，提示前者对3,5-二氯苯酚的敏感性略高。

表3 3,5-二氯苯酚对青萍和稀脉浮萍7 d平均特定生长率的抑制效应浓度(ErCx)

注：#括号内为ErCx的95%置信限，余同；*国际比对结果平均值[2]。

Note:#The values in parentheses stand for 95% confidence limits of ErCx, and others are the same.*the mean values from the results of international interlaboratory tests[2].

图3 基于叶状体数和总叶面积的平均特定生长率，青萍(a,b)和稀脉浮萍(c,d)暴露于3,5-二氯苯酚7 d的浓度-生长抑制效应曲线Fig. 3 Based on specific growth rate of frond number and total frond area, concentration-effect curves for growth inhibition of L. minor (a,b) and L. aequinoctialis (c,d) exposed to 3,5-dichlorophenol for seven days

表4 3,5-二氯苯酚对青萍和稀脉浮萍7 d

3 讨论(Discussion)

按照OECD化学品测试准则No. 221[3]的要求，浮萍叶状体数是首选的毒性效应终点，另外再从叶面积、干重、鲜重中选择一个终点进行测定。本研究发现，与青萍一样，稀脉浮萍的总叶面积与叶状体数的相关性最好，干重次之，鲜重最差(表1)。这一方面与OECD准则规定的各效应终点优先度排序相吻合，另一方面也表明上述效应终点同样适用于稀脉浮萍。此外，虽然干重或鲜重能够直接反映生物量的大小，但是需要事先对浮萍进行破坏性的物理处理才能测定，从而无法对同一植株的浮萍进行多次测定和分析从而获得生长曲线，也难以实现各平行在试验前后的自身对比。对于叶面积，只要具备简单的图像采集和分析系统，即可通过观测整株浮萍的总叶面积大小来反映其生物量的大小，能够满足在不同试验时点的观测要求。青萍和稀脉浮萍均为漂浮植物，整个叶面位于水平面，很少重叠，有利于叶面积的测定。因此，在随后的毒性试验中，选择总叶面积作为叶状体数的辅助终点。

为了比较两种浮萍对参比物质3,5-二氯苯酚的毒性响应情况，本研究遵从GLP实验室规范，采用OECD化学品测试准则No. 221[3]进行了浮萍生长抑制试验。以叶状体数和总叶面积作为效应终点，两种浮萍表现出相似的时间-效应关系和浓度-效应关系。根据平均特定生长率分别估算出3,5-二氯苯酚对两种浮萍的毒性效应浓度ErCx，同国际比对试验报告的结果具有可比性，且数值上接近。这既说明试验过程的质量保证符合要求，还表明稀脉浮萍对3,5-二氯苯酚的毒性响应程度与青萍处于相同水平。实验室内部关于化学品或废水测试的历史研究数据也表明，稀脉浮萍的参比试验结果具有稳定性和可重复性。

ISO 20079[2]指出，Steinberg培养基仅可用于青萍的培养，但经过长达一年的实验室暂养实践表明，该培养基对稀脉浮萍同样适用，期间浮萍生长健康、无异常表观。本研究也显示，稀脉浮萍在与青萍相同的培养和试验条件下，能够获得可靠的试验结果。针对金属化合物和含金属废水的毒性测试，ISO 20079[2]还建议采用APHA 培养基。另外，通过氯化钾参比试验证实该培养基对稀脉浮萍的适用性的工作正在顺利进行，结果将在其他文章中详细阐述。

本研究从浮萍生长抑制试验的技术标准化出发，验证了我国本土浮萍种属的适用性。在浮萍科的4个属中，浮萍属(Lemna L.)在毒性测试中是最常见的[6]，其中青萍(L. minor)和圆瘤浮萍(L. gibba)得到了OECD[3]和美国环保署[4]的推荐，但并未排斥使用其他浮萍属植物。而植物分布具有地域特征，即地理差异使得各地区具有不同的植物区系组成。利用本土植物更具本土植物区系代表性，更能反映本土植物对环境的适应特点。因此，在制定国家标准时，既要选取国际上广泛认可的青萍作为标准试验生物，也应该对分布广泛的其他浮萍种进行适用性检验，作为备选材料，以满足我国不同地域的需要。

我国目前已发现的浮萍属中包括青萍、稀脉浮萍和三叉浮萍(L. trisulca)3个种[17]，南北分布差异较大。如上海地区目前发现有青萍和稀脉浮萍，北京地区既有青萍又有三叉浮萍，而在东北和云南3种都有。由于三叉浮萍是一种悬浮植物，常聚成团或层片，仅在开花时浮至水面，不利于叶状体计数和叶面积测量，故不宜作为标准试验生物。而稀脉浮萍的物种特征与青萍较为接近，是适宜的候选试验生物。

传统上，由于藻类培养系统的简易性使之成为主要的水生植物毒性评价试验生物，将它们的毒性数据外推到水生维管束植物和陆生植物的来使用。然而，有数据表明在20%的测试中藻类敏感性不如维管束植物[6]。另外，与藻类相比，利用以浮萍为代表的水生维管束植物进行毒性评价有两大优势：一是应用范围更广，除了化学品测试，还可以用于几乎所有样品，比如各类工业和城市排放废水、垃圾或矿堆渗透液，尤其是对那些因为浑浊和有颜色而不能使用藻类进行测试的复杂样品；二是可以采用更新或流水方式进行试验，这对于那些毒性不稳定或随时间变化的样品而言非常重要[18]。因此，有必要建立基于本土浮萍的试验技术标准，为我国化学品测试和环境基准研究提供可靠手段。

综上所述，在浮萍生长抑制试验中，青萍的培养条件、试验方法和毒性效应终点均适用于稀脉浮萍。稀脉浮萍在我国分布广泛，容易获取，可作为毒性测试的国家标准试验生物。

致谢：感谢华东师范大学生命科学学院李宏庆教授的帮助和支持。

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◆

The Applicability ofLemnaaequinoctialisto Growth Inhibition Test ofLemnaminor

Liang Yihuai, Zhang Kun, Zhang Jingji, Liu Min, Zhao Huaqing, Yin Haowen*

Bioassay and Safety Assessment Laboratory, Shanghai Academy of Public Measurement, Shanghai 201203, China

18 March 2014 accepted 20 May 2014

To validate whether native Lemna aequinoctialis (commonly found in China) is suitable for the growth inhibition test using Lemna minor as standard test organism, these two Lemna species were compared regarding to the measured toxicity endpoints and the difference in responses to chemical exposure. The correlations of total frond area, fresh weight and dry weight with frond number of L. minor and L. aequinoctialis were investigated. In compliant with Good Laboratory Practices (GLP), a seven-day semi-static toxicity test was performed using the two duckweeds exposed to 3,5-dichlorophenol (as reference substance) at concentrations from 1.0 mg L-1to 10 mg L-1, according to "OECD Guidelines for the Testing of Chemicals No. 221 Lemna sp. Growth Inhibition Test". It was found that cultivation conditions, test procedures and toxicity endpoints for L. minor were applicable to L. aequinoctialis. The test of the two duckweeds showed the similar time-effect relationship as well as the dose-effect relationship; and those effect concentrations at each level were comparable and approximate. In conclusion, L. aequinoctialis can serve as test organisms as L. minor. L. aequinoctialis can become a candidate of the national standard species in toxicity testing.

3,5-dichlorophenol； Lemna aequinoctialis; Lemna minor; growth in hibition; frond number; total frond area

上海市科学技术委员会技术标准专项(12DZ0502600)

梁艺怀(1981-)，男，医学博士，主要研究方向为化学品风险评价、毒理学和生态毒理学，E-mail: liangyh@apm.sh.cn；

*通讯作者(Corresponding author)，E-mail: yinhw@apm.sh.cn

10.7524/AJE.1673-5897-20140318001

2014-03-18 录用日期：2014-05-20

1673-5897(2015)1-305-07

X171.5

A

殷浩文 (1959—)，男，教授级高级工程师，主要研究方向为化学品风险评价和生态毒理学，发表学术论文40余篇，专著及合著6部。

梁艺怀，张琨，张京佶，等. 青萍生长抑制试验对稀脉浮萍的适用性研究[J]. 生态毒理学报，2015, 10(1): 305-311

Liang Y H, Zhang K, Zhang J J, et al. The applicability of Lemna aequinoctialis to growth inhibition test of Lemna minor [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(1): 305-311 (in Chinese)