骨质疏松绵羊腰椎内不同椎弓根螺钉界面的组织学研究

刘达，康夏，谢庆云，张波，周江军，王财儒，郑伟，雷伟，潘显明*

(1.成都军区总医院骨科，四川 成都 610083；2.南京军区第184医院骨科，江西 鹰潭 335000；3.第四军医大学西京医院骨科，陕西 西安 710032)

实验研究

骨质疏松绵羊腰椎内不同椎弓根螺钉界面的组织学研究

刘达1，康夏1，谢庆云1，张波1，周江军2，王财儒1，郑伟1，雷伟3，潘显明1*

(1.成都军区总医院骨科，四川 成都 610083；2.南京军区第184医院骨科，江西 鹰潭 335000；3.第四军医大学西京医院骨科，陕西 西安 710032)

目的 通过硬组织切片及染色技术观察骨质疏松绵羊腰椎内膨胀式椎弓根螺钉(expansive pedicle screw，EPS)与骨水泥强化螺钉(polymethylmethacrylate-augmented pedicle screw，PMMA-PS)的钉道界面。方法 建立骨质疏松绵羊后将每只绵羊的腰椎(L1～6)随机分入三个不同的置钉组。使用相同的方法制备钉道后，普通椎弓根螺钉(CPS)组：经椎弓根向椎体内拧入CPS；PMMA-PS组：向制备好的钉道内注入1.0 mL的PMMA后拧入CPS；EPS组：直接经椎弓根向椎体内拧入EPS。术后6周和12周处死绵羊，经硬组织切片及染色后行组织学观察。结果 组织学观察表明，在术后6周和12周，CPS组和EPS组中骨小梁直接与螺钉接触，形成了“螺钉-骨质”界面。PMMA-PS组中PMMA包裹螺钉，阻碍了螺钉与骨小梁的直接接触，形成了“螺钉-PMMA-骨质”界面，EPS组螺钉的前端明显膨胀形成了一个“爪状”结构，挤压并显著改善了局部的骨质条件。从术后6周到12周，CPS组和PMMA-PS组中螺钉周围的骨质条件无明显变化，PMMA无明显降解吸收，PMMA组中形成了二次界面，然而，术后12周EPS前端周围的骨质情况和钉道界面均明显优于术后6周。结论 在骨质疏松绵羊腰椎内，术后早期EPS通过螺钉前段的膨胀挤压刺激周围骨小梁生长，显著改善了周围的骨质基础，随着螺钉膨胀部分持续挤压的刺激，螺钉前段周围的骨质条件在远期有进一步的显著改善，形成了良好的生物性界面，为螺钉的远期稳定提供了良好的骨质条件。

骨质疏松椎体；膨胀式椎弓根螺钉；聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥；钉道界面；组织学观察

目前，椎弓根螺钉系统已经成为脊柱外科的核心技术之一，并被广泛的应用于临床[1-3]。然而，骨质疏松严重影响螺钉的稳定性[4]，造成严重并发症，甚至需要进行翻修手术。为有效提高骨质疏松条件下螺钉的稳定性，我们在前期设计出膨胀式椎弓根螺钉(expansive pedicle screw，EPS)，实验发现EPS可以显著提高脊柱螺钉的固定强度[5-8]，且不增加螺钉的长度和螺钉在椎弓根的直径，可以有效的降低因改进螺钉设计带来的诸多风险。

回顾大量文献后发现：纵然聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate，PMMA)具有许多不足之处，但凭借其出色的力学强度和强化作用目前仍然被用于强化螺钉的稳定性[9-11]。而钉道界面情况是螺钉稳定固定的前提条件，特别是在体内，钉道界面的变化直接决定螺钉等内固定的动态稳定性及远期稳定性。因此，对于椎弓根螺钉钉道界面的研究有助于深入了解螺钉在体内稳定的机制。

目前，EPS和传统PMMA骨水泥强化螺钉(polymethylmethacrylate-augmented pedicle screw，PMMA-PS)谁具有更良好的界面呢？目前国内外的相关研究甚少。因此，本研究旨在通过硬组织切片及染色技术来观察两种不同椎弓根螺钉在骨质疏松绵羊腰椎中的钉道界面的组织学情况。

1 资料与方法

1.1 实验材料及仪器 普通椎弓根螺钉(conventional pedicle screw，CPS)长度20.0 mm，直径4.5 mm(见图1a)。膨胀式椎弓根螺钉(expansive pedicle screw，EPS)长度20.0 mm，直径4.5 mm，中央空腔直径为1.0 mm。螺钉的前半段有一纵向裂隙，通过中央空腔将内栓插入螺钉后使螺钉的前段膨胀(图1b～1c)。CPS 64枚，EPS(含配套内栓、压棒和顶丝)32枚，所有螺钉均由医用钛合金制成，由山东枢法模-威高骨科医疗器械公司提供。PMMA骨水泥(天津合成材料工业研究所生产)用来强化螺钉。双能X线吸收骨密度仪(Lunar Corp，Madison，WI，USA)由成都军区总医院内分泌科提供。eXplore Locus SP型Micro-CT(Healthcare，GE，USA)、轮转式硬组织切片机(Leica-LA 2500，Germany)和全自动显微镜(Leica-LA，Germany)均由西京医院全军骨科研究所提供。

1.2 动物及模型建立 8只健康成年雌性绵羊，体重(55.7±5.6) kg，年龄(5.5±0.7) 岁，均已过生育哺乳期，由成都军区总医院实验动物中心提供。所有涉及动物实验的操作均严格遵守国家及成都军区总医院关于动物实验的医学伦理学规定。速眠新(0.1 mL/kg)，中国人民解放军农牧大学军事兽医研究所研制)麻醉成功后，取俯卧位测量绵羊去势前腰椎的骨密度(bone mineral density，BMD)。然后对所有绵羊行双侧卵巢切除术。术前半小时及术后肌注头孢唑啉钠1.0 g，2次/d，共3 d。术后1个月开始肌肉注射甲基强的松龙(0.45 mg/kg)，连续注射9个月后逐渐减量至停止(共10个月)，观察1个月无不良反应后再次测量绵羊腰椎BMD。当绵羊腰椎BMD显著下降，且下降>25%时确定骨质疏松动物脊柱模型建立成功[12]。

图1 普通椎弓根螺钉(CPS)和膨胀式椎弓根螺钉(EPS)

1.3 实验方法 麻醉成功后，绵羊取俯卧位，取腰部正中切口逐层切开，分离显露L1～6的椎板及横突。采用人字嵴顶点法确定进钉点，与棘突成40°角方向制备钉道，深度为20 mm，透视确定定位针位置良好。每只绵羊的腰椎(L1～6)随机分入三个不同的置钉组，CPS组：经钉道向椎体内直接拧入CPS；PMMA-PS组：向钉道注入PMMA(1.0 mL)后再拧入CPS；EPS组：直接拧入EPS。置钉成功后依次缝合切口。围手术期给予头孢唑啉钠预防感染。密切观察术后动物生命体征、饮食、双下肢活动及切口愈合情况。术后6周和12周分别随机处死4只绵羊，取出带有螺钉的腰椎，游离成单个椎体。每个腰椎随机选择一侧椎弓根螺钉进行组织学观察。

1.4 组织学观察 用环钻沿螺钉的长轴钻取含螺钉的、直径约1.5 cm的圆柱状标本。将标本用10%中性甲醛固定5 d，不脱钙，依次经70%、80%、90%、99%、100%的乙醇进行脱水(各18 h)，然后依次浸泡塑料液，包埋后固化成块。使用轮转式硬组织切片机，垂直于螺钉长轴的方向将螺钉的前端连同周围骨组织连续切成厚度约30～50 μm的3张切片，对切片进行丽春红-三色染色，使用全自动显微镜观察钉道界面的情况。

2 结 果

2.1 大体观察 麻醉清醒后绵羊可站立，术后第2天可自行行走。术后饮食、双下肢活动及切口情况均未见明显异常。术后2周，切口甲级愈合，给予拆线。术后未见任何脊髓、神经压迫症状。

2.2 绵羊腰椎BMD 建模前后绵羊腰椎的BMD分别为(1.14±0.10) g/cm2和(0.83±0.07) g/cm2，建模后BMD下降平均为27.2%，差异具有统计学意义(P<0.05)，骨质疏松绵羊模型建立成功。

2.3 组织学观察 CPS组中，骨小梁直接与螺钉表面接触，钉骨之间形成了“螺钉-骨质”界面。术后6周，螺钉周围的骨小梁数量较少，排列稀松，局部可见明显的骨小梁断裂，未见典型的髓腔结构(见图2a～2b)。随着时间的延长，术后12周螺钉周围的骨质情况(骨小梁数量和密度)未见明显变化(见图2c～2 d)。

图2 CPS组中钉道界面的组织学观察

PMMA-PS组中，术后6周PMMA严密包裹螺钉，存在于钉骨之间及钉道周围的骨髓腔内，阻碍了骨小梁与螺钉的直接接触，钉骨之间形成了“螺钉-PMMA-骨质”界面(见图3a～3b)。由于PMMA的存在，螺钉与骨小梁之间的界限模糊不清。随着时间的延长，术后12周螺钉周围的骨质情况未见明显变化，PMMA未见任何降解、吸收迹象，仍然存在于钉道周围的骨质中，钉骨之间形成了二次界面(见图3c～3 d)。

EPS组中，术后6周螺钉的前段膨胀、挤压周围骨质，并刺激局部骨小梁生长，使螺钉前段周围的骨质条件较CPS组有显著改善(见图4a～4b)。从术后6周到术后12周，螺钉的膨胀部分周围的骨小梁数量明显增加，新生骨不断包绕螺钉并长入缝隙，成熟的骨组织完全取代了早期的纤维组织，骨小梁之间相互连接形成了典型的髓腔结构，进一步改善了局部的骨质情况(见图4c～4 d)。钉骨之间形成了良好的“螺钉-骨质”界面。

图3 PMMA-PS组中钉道界面的组织学观察

图4 CPS组中钉道界面的组织学观察

3 讨 论

为了避免因增加螺钉直径和长度导致的诸多风险，我们前期研制出前段膨胀的椎弓根螺钉。通过体外生物力学实验证实[5]，与USS，Tenor，CDH等普通螺钉相比，EPS可使稳定性提高48.4%、40.8%和25.3%。动物体内研究表明，EPS的前段膨胀，在体内形成了“钉中有骨，骨中有钉”的立体嵌合模式，较好的保证了螺钉在骨质疏松条件下的远期稳定性[6]，在骨质疏松尸体腰椎中可以达到接近传统的PMMA强化方法的稳定性[7]。PMMA因其良好的机械强度被广泛的应用于螺钉的强化处理[9-11]。然而，螺钉的稳定性取决于钉道界面的强度，体内钉道界面的动态变化直接影响螺钉在体内的稳定性，目前国内尚无关于动物体内EPS与PMMA-PS钉道界面情况的比较研究。

传统的X线和CT检查可以清楚的显示螺钉的位置及植骨融合等情况。然而，这两种方法存在着很多的局限性，由于分辨率的原因，X线检查不能准确的观察钉道周围的骨质情况及钉道界面情况，常常会受到诸多条件的影响；CT重建会因为螺钉的伪影而影响钉道界面的评价。更为重要的是，上述两种方法均不能直观的观察螺钉周围骨质的生长情况和钉道界面情况。因此，有必要使用更微观、更直接、更清晰的方法来研究钉道界面的情况。

组织学观察是采用不同的化学方法对标本进行染色，使组织被染上特定的颜色便于微观结构的观察。一般方法如下：将螺钉带周围骨组织制成特定形状的标本，先用10%的中性福尔马林或95%的酒精进行固定，再经一系列浓度梯度的乙醇进行脱水处理，然后进行塑料包埋，按照一定的方向将标本切成一定厚度的切片，使用不同的方法进行染色，最后可在显微镜下观察钉道界面的情况。

Mutsuzaki等[13]将磷酸钙涂层的螺钉置入日本大白兔的双侧胫骨近端，4周后取出螺钉带周围骨组织的标本，沿螺钉的纵向将标本切成厚度为30 μm的切片，使用苏木精和伊红(hematoxylin and eosin，HE)进行染色后发现：磷酸钙涂层螺钉周围的新生骨显著多于普通螺钉，且新生骨组织与螺钉接触良好，钉骨之间的接触情况明显优于普通螺钉，良好的钉骨界面为螺钉的稳定性提供了更为良好的骨质基础。Hasegawa等[14]将羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)涂层的椎弓根螺钉置入骨质疏松比格犬的腰椎中，术后10 d取出标本进行切片，使用甲苯胺蓝染色法后发现：HA涂层的椎弓根螺钉周围可见新生骨组织与螺钉结合，钉骨之间接触良好，而普通螺钉周围仅与纤维组织结合。Xue等[15]拟通过阿伦膦酸盐来改善长白猪体内椎弓根螺钉的稳定性，术后3月取出标本后采用亮绿染色法进行组织染色，观察发现：经阿伦膦酸盐治疗后螺钉与周围骨质的结合率显著高于未治疗组，结果表明阿伦膦酸盐可促进周围骨质与螺钉的直接接触，显著改善了体内钉骨界面的情况。本课题组[6]采用丽春红-三色染色对早期设计的EPS在骨质疏松绵羊腰椎中的钉道界面情况进行观察后发现，螺钉膨胀部分周围的骨质不断包裹并长入螺钉前段的缝隙中，形成了良好的钉道界面，同时形成了“钉中有骨，骨中有钉”的交叉嵌合模式。刘达等[16]使用硫酸钙骨水泥来强化骨质疏松绵羊腰椎椎弓根螺钉的固定，术后3个月采用丽春红-三色染色对标本进行染色，研究表明：术后3个月螺钉周围的硫酸钙完全降解吸收，螺钉周围可见大量新生的骨小梁，与螺钉紧密结合，钉骨之间未见明显缝隙，螺钉周围的骨小梁数量及空间结构均明显优于普通螺钉，形成了较好的“螺钉-骨质”界面。大量的研究证实组织学方法可以直接、清晰的反映螺钉周围骨组织的生长情况及钉道界面的情况，目前已经被广泛的应用于动物体内的实验研究。

为了便于进行绵羊体内实验研究，前期我们设计出用于固定绵羊腰椎的膨胀式椎弓根螺钉和普通椎弓根螺钉，并进行了绵羊腰椎体外研究[8]。通过硬组织切片及染色后进行了组织学观察，结果表明：EPS螺钉的前段膨胀并挤压周围的骨质，提高了局部的骨质密度，在螺钉膨胀部分周围可见断裂的骨小梁，而骨小梁碎屑填充于螺钉前段的缝隙中。这可能是置钉过程中螺钉前段的缝隙对钉道周围骨组织的刮擦而造成的。这些骨小梁碎屑填充在螺钉前端的缝隙中，可能会为新骨的生成、攀爬及骨小梁结构的重建提供良好的骨质环境。另外，在离体绵羊腰椎中形成了即刻的“螺钉-骨质”界面，为体内两者的生物性结合和螺钉的远期稳定性奠定了基础。当然，体外实验的这些推测还需要进一步的体内实验来证实。

基于上述研究，本实验进一步在骨质疏松绵羊腰椎中比较EPS和PMMA-PS的钉骨界面情况。研究发现，EPS前段膨胀的两瓣挤压并刺激周围骨质生长，改善了螺钉前段周围的骨小梁数量和空间结构，在术后两个时间点上均明显优于CPS前段周围的骨质条件。同时，由于EPS前端的应力刺激持续存在，从术后6周到术后12周，螺钉前段周围的骨小梁数量明显增加，新生骨不断包绕螺钉及长入缝隙，成熟的骨组织完全取代了早期的纤维组织，骨小梁之间相互连接形成了典型的髓腔结构，进一步改善了局部的骨质情况，钉骨之间形成了良好的生物性界面。术后远期(12周)EPS前段周围的骨质情况和钉骨界面均明显优于近期(6周)。然而，CPS却没有这方面的优势，随着时间的延长，螺钉前段周围的骨小梁数量和空间结构并没有明显的改善。

我们还发现，PMMA-PS组中PMMA严密包绕螺钉，存在于螺钉与骨组织之间。然而，随着时间的延长，螺钉周围的骨质条件未见明显变化，未见PMMA降解、吸收的迹象。由于PMMA不降解，长期存在于螺钉与骨质之间，严重阻碍了螺钉与骨质的直接接触，无法形成螺钉与骨质的生物性整合，在钉骨之间形成了二次界面——“螺钉-PMMA-骨质”界面，为螺钉的远期稳定埋下了隐患。遗憾的是，本实验并没有观察到PMMA-PS钉道周围松动的迹象，可能与螺钉在体内放置时间过短及螺钉未成组安装等因素有关。本研究仅采用硬组织切片及染色技术对钉道进行了组织学观察，螺钉的稳定性还需要进一步的力学实验来证实。

通过体内研究我们发现，在骨质疏松绵羊腰椎内，术后早期EPS通过螺钉前段的膨胀挤压刺激周围骨小梁生长，显著改善了周围的骨质基础，随着螺钉膨胀部分持续挤压的刺激，螺钉前段周围的骨质条件在远期有进一步的显著改善，形成了良好的生物性界面，为螺钉的远期稳定提供了良好的骨质条件。

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Histological Comparison of Interfaces of Different Pedicle Screws in Osteoporotic sheep Lumbar Vertebrae

Liu Da，Kang Xia，Xie Qingyun，etal

(Department of Orthopaedics，Chengdu Military General Hospital，Chengdu 610083，China)

Objective To compare the interfaces of expansive pedicle screw(EPS)and polymethylmethacrylate-augmented pedicle screw(PMMA-PS)in osteoporotic sheep lumbar vertebrae through hard tissue sections and staining technique.Methods Six lumbar vertebrae(L1～6) in each sheep were divided into three groups randomly(two vertebrae with four pedicles in each group)after establishment of osteoporosis sheep.In CPS group，CPS was inserted through the pilot hole into vertebral body without any augmentation.In PMMA-PS group，PMMA(1.0 mL) was injected into the pilot hole prior to the insertion of CPS.In EPS group，EPS was inserted through pedicle into vertebral body.The sheep were sacrificed and lumbar vertebrae(L1～6) were harvested at the 6-week and 12-week post-operation，respectively.The histological observation was performed to evaluate the interfacial properties.Results It was clearly demonstrated in histological observations.The bone trabeculae wrapped up screw directly forming “screw-bone” interface in both CPS and EPS groups at both 6-week and 12 week post-operation.PMMA surrounding the screw hampered the direct contact between bone and screw and formed“screw-PMMA-bone”interface in PMMA-PS group.The anterior part of EPS presented an obvious expansion in vertebral body and formed a clawlike structure，which pressing the surrounding bone trabeculae and significantly improving the local bone condition(amount and density).From 6-week to 12-week post-operation，there was no visual difference in bone condition(amount and density)around screw in both CPS and PMMA-PS groups.PMMA was found remaining around screw without any degradation and absorption，which led to the second non-biological interface in PMMA-PS group.Nevertheless，bone condition(amount and density) around expanding part of EPS at 12 week were significantly improved compared with that at 6-week forming the good“screw-bone”interface.Conclusion EPS improve the bone condition around the anterior part of screw through expanding compression in early term in osteoporotic sheep lumbar vertebrae.Based on the stress stimulation from the continuous compression of anterior part of EPS，there is a significant improvement on the local bone condition in long term and form a good biological interface，which providing the good bone condition for the long-term stability.

osteoporotic vertebrae；expansive pedicle screw；polymethylmethacrylate bone cement；interface；histological observation

国家自然科学基金青年基金项目(81301606)，成都军区总医院院管课题资助项目(2013YG-B015)；

1008-5572(2015)01-0045-05

R318.01

A

2014-05-31

刘达(1982- )，男，主治医师，成都军区总医院骨科，610083。

*本文通讯作者：潘显明