氰基丙烯酸正丁酯纳米载体促进紫杉醇粒抗脑胶质瘤作用的实验研究①

李明军，李英夫，吴 雁，杨福义，王维峰，宣兆博

(1.佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154003;2.中科院国家纳米中心，北京 100000)

氰基丙烯酸正丁酯纳米载体促进紫杉醇粒抗脑胶质瘤作用的实验研究①

李明军1，李英夫1，吴 雁2，杨福义1，王维峰1，宣兆博1

(1.佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154003;2.中科院国家纳米中心，北京 100000)

目的：动物实验水平研究聚氰基丙烯酸正丁酯纳米载体促进紫杉醇粒抗脑胶质瘤的作用。方法：①紫杉醇-聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒悬液的制备。②制备胶质瘤模型，制备的胶质瘤模型随机分成四组，每组20只，Ⅰ组注射生理盐水、Ⅱ组注射紫杉醇、Ⅲ组注射PBCA+NP、Ⅳ组注射紫杉醇+PBCA+NP，15d后观察Wistar大鼠的变化，观察肿瘤病理切片，检测肿瘤细胞的凋亡率。结果：①Wistar大鼠的生存状态，Ⅳ组好于其它三组。②Ⅱ组和Ⅲ组Wistar大鼠脑胶质瘤血管的减少和坏死肿瘤组织比Ⅳ组少。③Wistar大鼠脑胶质瘤调亡率Ⅳ组高于Ⅱ组、Ⅲ组，具有统计学显著差异(P<0.05)。结论：聚氰基丙烯酸正丁酯纳米载体明显提高紫杉醇抗Wistar大鼠脑胶质瘤的作用。

聚氰基丙烯酸正丁酯紫杉醇;SHG-44;Wistar大鼠；病理

紫杉醇是天然抗肿瘤药物，提取于红豆杉的树干和树皮，对卵巢癌、肺癌、大肠癌、黑色素瘤、胶质瘤疗效明显，紫杉醇在水中溶解度低，影响其疗效，为提高其溶解度，采用溶解在聚氧乙烯蓖麻油内，也可溶解在乙醇内，虽然溶解度提高了，但给药后副作用明显增加，本课题组曾进行动物实验研究紫杉醇对实验动物的胶质瘤具有明显的抑制作用，为提高其疗效，对其给药方式进行了有益的探索，近年来随着纳米技术的发展，为临床给药开辟了新的途径，由于纳米载体毒副作用较小，而且能够降解，纳米载体具有靶向性，由于这一特性，增加了药物的疗效，具有很好的临床应用前景，本实验在Wistar大鼠脑胶质瘤模型成功建立后，在动物实验水平，观察紫杉醇聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒的抗胶质瘤作用，得到了很好的效果，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

Wistar雌性大鼠100只,体重350～500g,购于佳木斯大学实验动物中心，SanyoCO2培养箱，超净工作台等，光学显微镜，流式细胞仪，立体定向仪，SHG-44细胞株[1～4]。

1.1.1 脑胶质瘤模型的制备

①SHG-44细胞悬液的制备SHG-44来源于人额叶星形胶质瘤的稳定培养，具有特异性标志胶质酸性纤维蛋白(GFAP)，SHG-44是目前较理想的细胞株，能够稳定的培养，并在Wistar大鼠尾状核区成功植入，将复苏成功的SHG-44细胞株，放于50cm2培养瓶中接种，DMEM培养基中含有10%灭活的胎牛血清，还含有链霉素100mg/mL、青霉素100U/mL、NaHCO33.7g/L，培养瓶置于5%CO2的培养箱中，温度恒定于37℃，SHG-44细胞满瓶后,将培养液倾倒出去,0.25%胰酶消化培养瓶中的SHG-44细胞,显微镜下观察SHG-44细胞，当细胞开始皱缩时,加入营养液,并反复吹打，使SHG-44细胞脱壁,并用离心机离心5min，离心转数为1000r/min，将上清液弃出，制成106细胞/瓶的细胞悬液,接种于25cm2培养瓶中。

②SHG-44细胞悬液制备的接种 接种前3d，每日给予地塞米松，剂量为100g体重1mg，给药方式为灌胃，降低排斥反应，植入靶点为右侧尾状核区，穿刺点为矢状缝右旁开3.5cm和前囟中点前1.0cm，用10%水合氯醛麻醉，给药剂量为每100克体重0.4mL，麻醉满意后，将Wistar大鼠固定于立体定向仪上，剪去穿刺点周围毛,高效碘消毒,铺无菌洞巾，切开内眦连线与正中矢状面交点向后1cm，定位预先穿刺点，牙科钻颅骨钻孔，直径1.2mm，用1mm微量注射器针头刺破硬膜，向下垂直进入硬膜下6mm, 再后撤1mm，将细胞悬液1×106/20μL，以每分钟1μL的速度缓慢注入右侧尾状核区，穿刺针停留5min，骨蜡封闭骨孔，缝合头皮。

1.1.2 紫杉醇-聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒的制备

将300mgDextran-70放置于烧杯中，加蒸馏水搅拌使其溶解，pH值调至3.0，定容至50mL。于室温、电磁搅拌下缓缓加入浓度为1%的α-BCA0.5mL，搅拌4h后，pH调至8.5，用氢氧化钠溶液，制成空白的PBCA纳米粒胶体溶液。量取空白的PBCA溶液10mL，加入药物20mg，pH值调至7.0，搅拌4h后，得紫杉醇-PBCA-NP胶体溶液，取上述紫杉醇-PBCA-NP胶体溶液10mL，同时加入0.1mLT-80，搅拌半小时，置于恒温箱中孵化2h，温度恒定于37℃。

1.2 分组给药

MRI扫描Wistar大鼠头部，筛除过大过小的肿瘤，留取呈椭圆形、球形，筛除过大、过小的肿瘤，随机分成4组，每组10只，分开饲养。术后每日腹腔注射青霉素，剂量为每次10万单位。制备的胶质瘤模型随机分成四组，每组10只。

Ⅰ组 ：生理盐水(对照组)。Ⅱ组：紫杉醇(实验组)。Ⅲ组：PBCA+NP(实验组)。Ⅳ组：紫杉醇+PBCA+NP(实验组)。

1.3 指标测定

①观察Wistar大鼠生存状态。②肿瘤的组织病理学观察。③测定肿瘤细胞凋亡率。

1.4 统计学方法

采用SPSS11.5统计软件包进行统计分析，数据用均数±标准差表示，多组之间采用方差分析，两组之间采用Q检验，P<0.05具有显著差异。

2 结果

2.1 观察Wistar大鼠的生存状态精神萎靡，反应迟钝，食欲不振，体重下降，身体虚弱，活动明显减少，步态不稳等症状。Ⅳ组Wistar的以上表现，明显好于Ⅱ组和Ⅲ组。

2.2 肿瘤组织病理学切片

光镜下观察Wistar大鼠脑胶质瘤标本，肿瘤细胞呈小梭形，细胞核较大，有异形，可见核分裂相，染色质丰富，细胞质相对较少，实验组可见坏死灶，Ⅱ组和Ⅲ组Wistar大鼠脑胶质瘤血管的减少和坏死肿瘤组织比Ⅳ组少。

2.3 肿瘤细胞的凋亡率

见表1。

表1 各组肿瘤细胞凋亡率

3 讨论

胶质瘤是发生于神经外胚叶的胶质细胞肿瘤，是目前最顽固的肿瘤之一，治疗效果无突破性进展。中位生存时间改善不明显，目前仍以手术治疗为主，术后辅以放化疗，并且复发率极高，几乎可达到100%，对患者生活质量和寿命造成极大威胁，这是目前神经外科面临的极富挑战难题，广大的学者和临床医生正在探索新的治疗方法。随着化疗药物的制备工艺的提高，减少了化疗药物的毒副作用，化疗作为术后治疗的常用手段之一，化疗药具有明显的阈值，超过阈值可发挥抗癌作用，增加到一定量时具有明显的毒副作用，呈现剂量依赖性，导致化疗效果并不理想，治疗同时难免损伤正常脑细胞导致的并发症,随诊纳米技术的发展，为胶质瘤患者带来福音。药物通过包埋在粒子内部，以及吸附于粒子表面，纳米粒子输送药物具有如下特点：①缓释性，增加药物作用时间，②靶向性 增加了药效，③毒副作用小，④稳定性好，有利于储存等[5～6]。纳米粒子能穿透组织间隙并被细胞吸收，可通过人体最小的毛细血管。纳米粒子通过囊壁沥滤、渗透、本身的溶蚀等方式，把药物释放出来[7，8]。由于纳米粒子所均有的以上特性，提高了化疗药物的治疗效果，同时也减轻了毒副作用，前景广阔。

本实验在成功建立Wistar大鼠SHG-44脑胶质瘤模型的基础上，将生长满意的肿瘤，作为实验的肿瘤模型，随机分成4组，为Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组，Ⅰ组为对照组，注射生理盐水，实验组为Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组，Ⅱ组注射紫杉醇，Ⅲ组注射PBCA+NP，Ⅳ组注射紫杉醇+PBCA+NP，待注射药物10d后，观察Wistar大鼠的生存状态，测量肿瘤生长抑制率，测定肿瘤细胞的凋亡率，观察病理切片，结果Wistar大鼠的生存状态(精神萎靡，反应迟钝，食欲不振，体重下降，身体虚弱，活动明显减少，步态不稳等症状)，Ⅳ组Wistar的以上表现，明显好于Ⅱ组和Ⅲ组。肿瘤生长凋亡率Ⅱ组、Ⅲ组明显低于Ⅳ组，光镜下观察肿瘤标本，肿瘤组织坏死程度和血管的减少量Ⅳ组多于Ⅲ组和Ⅱ组，以上结果表明，动物实验水平上聚氰基丙烯酸正丁酯纳米载体具有明显促进紫杉醇粒抗脑胶质瘤作用，利用纳米载体所具有的特性，增加了肿瘤组织内药物的浓度，提高了药效，减少了毒副作用。

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黑龙江省卫计委课题项目，编号：2010-523。

李明军(1965～)男，黑龙江佳木斯人，学士，主任医师。

李英夫(1979～)男，黑龙江明水人，硕士，主治医师。E-mail：liyingfu79@sohu.com。

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1008-0104(2015)02-0029-02

2015-01-26)