摩西球囊霉菌对Pb胁迫下烟草解毒效应的研究

赵晓改，王 浩，高 杉，袁祖丽

(河南农业大学生命科学学院，河南 郑州 450002)



摩西球囊霉菌对Pb胁迫下烟草解毒效应的研究

赵晓改，王 浩，高 杉，袁祖丽

(河南农业大学生命科学学院，河南 郑州 450002)

以烟草(NicotianatabacumL．)品种中烟100为材料，采用盆栽试验，研究Pb胁迫下接种与未接种摩西球囊霉菌(Glomusmosseae，GM)对烟草的形态变化、叶绿素含量、菌根侵染率、球囊霉素(GRSP)含量、Pb含量(包括土壤残留、根、烟叶和球囊霉素中)等的影响，以探讨Pb胁迫下GM对烟草的解毒效应。结果表明，接种GM后叶片变绿；叶绿素a(Cht a)和叶绿素b(Chl b)含量升高，Chl a/Chl b值显著升高；接种GM后菌根侵染率为32.72%和26.17%，显著地提高了GRSP含量；与同质量分数Pb胁迫未接种组相比，接种GM后根和土壤中残留Pb含量显著增加，而烟叶中Pb含量极显著减少，且下部叶>中部叶>上部叶。

Pb；摩西球囊霉菌；烟草；解毒能力

全世界每年平均排放铅(Pb)约500 t[1]，中国受Pb、镉(Cd)等重金属污染的耕地面积近2 000万hm2，约占总耕地面积的1/5[2]。重金属主要通过植物根部进入植物体内，在英国合法购买的香烟烟叶中Pb质量分数为0.4～0.9 mg·kg-1，而中国市场上常见香烟中Pb的质量分数为4.48 mg·kg-1[3，4]，因此降低中国烟叶中重金属的含量已成为提高烟叶品质的关键[5]。摩西球囊霉菌(Glomusmosseae，GM)为丛枝真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi , AMF)的一种，它能够增加植物根部吸收面积，促进作物生长。球囊霉素(Glomalin related soil protein，GRSP)是AMF分泌的一种糖蛋白，这种物质能够吸附土壤中的重金属，减少重金属对植株的毒害[6]，并增加植株耐干旱及病害之能力[7]。丛枝真菌可提高杨树[8]、黄芪[9]、小麦、大豆[10]和番茄[11]等植物的抗逆胁迫，而GM对Pb胁迫下烟草的解毒效应目前尚未见报道，因此，本研究以烟草中烟100为材料，根据文献[12]的标准，研究了不同质量分数Pb污染下，未接种与接种GM对烟草的形态、叶绿素含量、根系的侵染率、球囊霉素含量及Pb含量(包括：土壤残留、根、烟叶和球囊霉素中)的影响，探讨GM对烟草中Pb毒性的解除效应，为提高烟叶品质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及设计

1.1.1 试验材料 试验材料为烟草(NicotianatabacumL.)中烟100(原品系CF965)，由河南省农科院烟草研究中心提供。丛枝真菌为摩西球囊霉菌(Glomusmosseae),由北京市农林科学院植物营养与资源研究所的中国丛枝菌根真菌种质研究库提供。供试土壤为许昌市农田耕作表层土，土壤性质为壤质潮土，pH值为6.94；Pb本底值为22.74 mg·kg-1；有机质含量为14.38 g·kg-1；全氮和碱解氮为0.65 g·kg-1和45.81 mg·kg-1；全磷和速效磷为0.89 g·kg-1和20.42 mg·kg-1；全钾和有效钾分别是19.6 g·kg-1和238 mg·kg-1。装盆前土壤过筛，每盆装干土15 kg(盆钵直径36 cm，深42 cm)。为了防止重金属渗漏，在盆外套上塑料袋。施用化肥分别为 (NH4)2SO4、KH2PO4、KNO3(均为分析纯)，肥料均作基肥1次性施入。施N量按0.45 g·kg-1干土施用，氮、磷、钾比例为m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=16∶14∶15。

1.1.2 试验设计 试验设计为0、200(未接种)、200(接种GM)、400(未接种)和400(接种GM)mg·kg-1Pb。

1.1.3 试验处理 采用漂浮育苗的方法，取长势一致的烟苗(6片烟叶)，2013-05-06移栽，每盆移栽烟苗1株。移栽返苗7 d后，按照试验设计浓度将Pb(NO3)2溶解于1 000 mL蒸馏水中，以污灌的方式一次性施入，每个处理重复3次，管理同一般大田。

1.2 测定内容及方法

1.2.1 烟草形态变化 在接种处理后的60 d，分别观察记录烟草的形态变化。

1.2.2 叶绿素含量的测定 取接种处理60 d后的成熟烟叶片(自上而下的第4片叶)，采用文献[13]的方法测定叶绿素含量。

1.2.3 根系菌根侵染率的测定 取3级侧根的根毛为试验材料(1 cm)，将材料迅速放入FAA固定液中V(甲醛)∶V(冰醋酸)∶V(乙醇)=13∶5∶100，采用墨水染色观察法测定根系菌根侵染率。处理好的根段放在载玻片上，每个载玻片上放3根，根段与载玻片的短轴平行，滴上一滴甘油，放盖玻片，在10×10倍的视野下观察，根据根段侵染数量或程度分为0 ，10% ，20% ，30% ，…，100%侵染等级，依下列公式计算该样品菌根侵染率：侵染率(%)= ∑(0%×根段数+10%×根段数+20%×根段数+…+100%×根段数)/观察总根段数[14]。

1.2.4 球囊霉素(GRSP)含量及球囊霉素中Pb含量的测定 取根部周围10 cm、深度分别为5、10、15、20 cm)处的土壤，参照文献[15]的方法提取GRSP，GRSP含量的测定参照文献[16]的方法。GRSP中Pb含量的测定：取GRSP提取液10 mL，用电感耦合等离子体(ICP-MS) XSERISE2型高效液相色谱仪测定(方法编号：DD2005-01)。

1.2.5 根、烟叶及土壤中Pb含量的测定 在采收期分别取各处理的根(根毛区及以下根段)、下部烟叶(自下向上3和4片)、中部烟叶(自下向上7和8片)、上部烟叶(自下向上11和12片)和根际周围不同深度(5、10、15、20 cm)的土壤。将材料置于烘箱中80 ℃烘干72 h，分别取烘干磨碎(过40目筛)的烟根、烟叶及土壤0.500 g, 用上述高效液相色谱仪测定(方法编号：DD2005-01)。

1.2.6 数据分析 以上每项试验重复测定3次，数据采用DPS V7.05进行单因素统计分析。

2 结果与分析

2.1 Pb胁迫下接种GM对烟草形态的影响

图1表明，Pb含量200 mg·kg-1胁迫下，造成烟草叶片轻微变黄，而Pb含量400 mg·kg-1胁迫下，烟草叶片显著变黄，接种GM后烟草在形态上呈现生长健康状态。因此，从形态上可以看出，接种GM后会对Pb胁迫起到一定的修复作用。

A．对照；B．200未接种；C 200接种；D．400未接种；E．400接种.A．contrast；B．200 inoculation；C 200 uninoculation；D．400 inoculation；E．400 uninoculation.

2.2 Pb胁迫下接种GM对烟草叶片叶绿素含量的影响

由表1可知，Pb胁迫下的烟草与对照(未施入Pb和GM)相比，施入Pb的烟草叶片Chl a、Chl b、Chl (a+b)和Chl a/Chl b值均不同程度降低，说明施入Pb后，烟草叶片中与光合作用密切相关的叶绿素合成受阻或受到破坏。200(未接种)和200(接种GM)相比，Chla、Chlb、Chl(a+b)和Chla/Chlb值均不同程度下降，降低幅度分别为：22.46%、19.05%、21.56%和2.86%； 400(未接种)和400(接种GM)相比，降低幅度分别为：30.37%、25.00%、28.86%和4.30%。其中的Chl a含量下降达到极显著水平(P<0.01)，Chlb和Chl(a+b)含量下降达到显著水平(P<0.05)。

表1 Pb胁迫下接种GM对烟草叶片叶绿素含量的影响Table 1 Effect of inoculation with GM on chlorophyll content in tobacco leaves under Pb stress

注：不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。下同。

Note: lower-case letters show the significant difference at 0.05 level. The same as below.

2.3 GM对烟草根系侵染率

对各处理烟草根系菌根侵染率的研究(图2)表明，未接种GM的烟草未检测到其根系有菌根侵染，而接种GM与施入同质量分数Pb的烟草相比，200、400 mg·kg-1Pb与200接种，400接种根系菌根侵染率分别为32.72%和26.17%。

A：对照；B：200未接种；C：200接种；D：400未接种；E：400接种。A．contrast；B．200 inoculation；C.200 uninoculation；D．400 inoculation；E．400 uninoculation.

2.4 Pb胁迫下接种GM对烟草根际土壤中GRSP含量及GRSP中Pb含量的影响

由表2可知，对照、Pb胁迫下(200和400)未接种GM的根际土壤中GRSP含量分别为15.40、14.03、14.50 mg·kg-1，而Pb胁迫下(200和400)接种GM根际土壤中GRSP含量达到了406.00、452.67 mg·kg-1，与未接种相比分别增加了28.93和31.22倍；对照、Pb胁迫下( 200和400)未接种GM的根际土壤GRSP中Pb的含量分别为656.51、1 672.98和2 488.57 ng·g-1，而Pb胁迫(200和400)下接种GM根际土壤GRSP中Pb的含量分别为3 331.67、8 939.84 ng·g-1，比未接种增加了1.99和3.59倍。

表2 Pb胁迫下接种GM对烟草根际土壤中GRSP含量及GRSP中Pb含量的影响Table 2 Effect of inoculation with GM on GRSP content and Pb content in GRSP in tobacco rhizosphere soil under Pb stress

2.5 Pb胁迫下接种GM对烟草烟叶、根及土壤残留的影响

表3显示，Pb胁迫下(200和400)，烟草接种GM与未接种相比，根系中Pb含量分别增加了72.76和73.4 mg·kg-1；土壤残留中Pb含量分别增加了31.67和51.06 mg·kg-1；下部烟叶中Pb含量分别减少了1.52和3.55 mg·kg-1；中部烟叶分别减少了1.56和1.50 mg·kg-1；上部烟叶分别减少了1.64和1.00 mg·kg-1，和未接种组烟叶中Pb含量相比，接种GM后，叶片中Pb含量显著减少，不同处理下叶片中Pb含量为下部叶>中部叶>上部叶。

表3 Pb胁迫下接种GM对烟草烟叶、根及土壤中Pb含量的影响Table 3 Effect of inoculation with GM on Pb concentration in leaves, roots and rhizosphere soil

3 讨论

虽然Pb是植物的非必需元素，但很容易被植物吸收，且多数积累在根系，仅少量进入地上部[18]，本研究结果与PATRA等的研究结果一致。叶绿体不仅是植物光合作用的场所，也是细胞中对重金属最敏感的细胞器[19]，过量的Pb能导致叶绿体基粒垛叠结构的解体及与片层结构有关的基质明显减少，且Pb在植物体内还可能与酶蛋白的-SH基或其它侧链结合，取代Fe、Mg、Zn等离子，抑制包括叶绿素酸酯还原酶在内的一系列与叶绿素合成有关的酶活性，如δ-氨基乙酰丙酸脱水酶的活性[20]。而接种GM后，烟叶呈现健康生长状态，叶绿素含量升高，这与王晓敏等[21]研究一致，可能是接种GM后，叶片中Pb含量降低，从而减小了Pb对叶绿体的破坏或降低了Pb对烟草叶绿素合成的阻碍。

土壤中80%以上的GRSP紧密地结合在根外菌丝和孢子上，与菌丝壁形成一些难溶性的复合物或松散地陷入菌丝壁，阻止重金属向上转移[24]，接种GM后，一方面，根际土壤中GRSP含量显著增加，GRSP螯合大量的Pb于根际，土壤中Pb的生物有效性大大降低，使烟叶呈健康生长状态。另一方面，随着菌丝对根系的侵染，根系内GRSP结合Pb的含量增加，造成根系Pb含量增加，使得接种组烟叶各部分Pb含量(下、中和上叶)显著低于未接种组，且下部叶>中部叶>上部叶。研究结果，显示接种GM可降低Pb污染地区烟叶中Pb含量。

[1] 周泽义．中国蔬菜重金属污染及控制[J]．资源生态环境网络研究动态，1999，10(3):21-27．

[2] 桑爱云，张黎明，曹启民，等．土壤重金属污染的植物修复研究现状与发展前景[J]．热带农业科学，2006，26(1)：75-76．

[3] 周 敏．环境Pb污染与Pb毒危害[J]．中国煤炭工业医学杂志，2004，19(4):267-268．

[4] KAMAL S,CHRISTOPHER D.Trace metals analysis of legal and counterfeit cigarette tobacco samples using inductively coupled plasma mass spectrometry and cold vapor atomic absorption spectrometry[J].Spectroscopy Letters, 2009,42:479-490.

[5] 李义强，王凤龙，龚道新．我国无公害烟叶生产的问题、优势及对策[J]．中国烟草科学，2009，30(3):54-57．

[6] WRIGHT S. UPADHYAYA A.A survey of soils for aggregate stability and glomalin, a glycoprotein produced by hyphae of arbuscularmycorrhizal fungi[J]. Plant and soil，1998，198(1): 97-107．

[7] 弓明钦，陈应龙，仲崇禄．菌根研究及应用[M]．北京：中国林业出版社，1997．

[8] 湛 蔚，刘洪光，唐 明．菌根真菌提高杨树抗溃疡病生理生化机制的研究[J]．西北植物学报，2010，30(12)：2437-2443．

[9] 石 蕾，贺学礼．不同施P水平下AM真菌对黄芪生长和生理学特性的影响[J]．西北农业学报，2007，16(1)：46-50．

[10]郑红丽，邢 杰，胡 俊．两种丛枝菌根真菌对小麦和大豆生长的影响[J]．内蒙古农业大学学报，2002，23(1)22-23．

[11]李 敏，辛 华，郭绍霞，等．AM真菌对盐渍土中番茄，辣椒生长和矿质养分吸收的影响[J]．莱阳农学院学报，2005，22(1):38-41．

[12]夏佳琪．土壤环境质量标准详解[M].北京：中国环境科学出版社，1996．

[13]李合生．植物生理生化实验原理和技术[M]．北京：高等教育出版社，2000．

[14]李合生．植物生理生化实验原理和技术[M]．北京：高等教育出版社，2000．

[15]谢小林，许朋阳，朱红惠，等．球囊霉素相关土壤蛋白质的提取条件[J]．菌物学报，2011，30(1): 92-99．

[16]刘晓蕾．土壤中总球囊霉素测定方法的研究及初步应用[D]．北京:中国农业大学，2006．

[17]WRIGHT S.Time-course study and partial characterization of a protein on hyphae of arbuscularmycorrhizal fungi during active colonization of roots[J]. Plant and Soil, 1996，181(2)： 193-203.

[18]PATRA M, BHOWMIK N, BANDOPADHYAY B, et al. Comparison of mercury,lead and arsenic with respect to genotoxic effects on plant systems and the development of genetic tolerance[J]. Environ Exp Bot, 2004，52(2)： 199-223．

[19]项海波，刘东武，张 苗，等．基于叶绿素荧光强度分析蔬菜重金属污染[J]．食品研究与开发，2013，34(22):8-10．

[20]BEALE S I, CASTELFRANCO P A．The biosynthesis of aminolevulinic acid in higher plants: accumulation of aminolevulinic acid in greening plant tissues[J].Plant Physiol, 1974，53(2):291-296．

[21]王晓敏，王书成．重金属对烟草的影响及其治理[J].河北农业科学，2008，12(7):15-l7．

[22]申 鸿．丛枝菌根真菌 (Glomuscaledonium) 对铜污染土壤生物修复机理初探[J]．植物营养与肥料学报，2005， 11(2): 199-204．

[23]鲁先文，宋小龙，王 三，等．重金属铅对小麦叶绿素合成的影响[J]．潍坊教育学院学报，2008，21(2)：46-47．

[24]DRIVER J D,H0LBENAND W E, RILLIG M C. Characterization of glomalin as a hyphal wall component of arbuscularmycorrhizal fungi[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2005. 37(1): 101-106.

[25]LI X L, ZHANG J L, ECKHARD G . Phosphorus acquisition of VA mycorrhizal hyphae from compacted soil in clover[J]. J Can Botony, 1997，75(5): 723-729．

(责任编辑：朱秀英)

Effects of inoculation withGlomusmosseaeon toxicity in tobacco under Pb stress

ZHAO Xiaogai，WANG Hao，GAO Shan，YUAN Zuli

(College of Life Sciences，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China)

Taking tobacco (NicotianatabacumL.) cultivars smoke 100 as the material, a pot experiment, researchers inoculated with Glomus fungal (Glomusmosseaereferred to as GM) was conducted to improve the ability to influence the toxicity of Pb in Pb stress. Vaccinated with unvaccinated morphological changes in tobacco, chlorophyll, mycorrhizal infection rate, the glomalin (GRSP) content, Pb content (residual soil, roots, tobacco and glomalin) and other studies were carried out to investigate the GM for physiological and ecological characteristics of tobacco plants affected. The results showed that GM tobacco leaf morphology after inoculation grown green chlorophyll a (Cht a) and chlorophyll b (Chl b) content increased, the value of Chl a/Chl b increased significantly; clump planting fungal inoculation significantly increased the mycorrhizal invasion tobacco, root, group compared with the soil residual Pb content with the same mass concentration unvaccinated, roots, soil residual Pb content increased significantly, significantly reducing to baccoPb content, and the lower leaves> middle leaves>; dye uptake and GRSP content in upper leaves. GRSP indicate chelation of Pb resulted in a significant reduction of Pb content in the soil and roots, making tobacco Pb content decreased significantly.

Pb；Glomusmosseae；tobacco；detoxification

2014-06-20

河南省科技厅基础前沿项目(142300410152)

赵晓改(1987-)，女，河南禹州人，硕士研究生，主要从事烟草重金属方面的研究。

袁祖丽(1963-)，女，河南郑州人，教授，博士。

1000-2340(2015)02-0153-05

S572

A