镀银碳纤维在烟粉虱EPG记录中的应用

卢少华， 潘建斌， 宋 熙, 闫凤鸣

(1.河南农业大学植物保护学院，河南 郑州 450002；2.河南农业大学理学院，河南 郑州 450002)



镀银碳纤维在烟粉虱EPG记录中的应用

卢少华1， 潘建斌2， 宋 熙1, 闫凤鸣1

(1.河南农业大学植物保护学院，河南 郑州 450002；2.河南农业大学理学院，河南 郑州 450002)

为探索新材料，降低昆虫刺吸电位技术(Electrical Penetration Graph，EPG)的测试成本，本研究以镀银碳纤维为材料，以金丝为对照，在直流刺吸电位仪(DC-EPG)上测试Q型烟粉虱Bemisiatabaci的取食行为，并对波形进行分析比较。结果表明，利用镀银碳纤维记录的EPG波形总体上与金丝的非常类似；分析几类典型波形可以发现，与金丝相比，镀银碳纤维记录的pd波相对振幅显著下降，且pd-Ⅱ亚波的Ⅱ-1和Ⅱ-3部分的频率显著增大；E2波电压水平显著低于金丝记录的水平，而两者记录韧皮部参数的相对振幅和频率以及E1波的电压水平差异均不显著。说明镀银碳纤维在一定程度上能够改进EPG的记录结果，提高波形的精确性，可以在EPG实验中替代金丝，但在导电性方面尚有改进的空间。

刺吸电位技术；金丝；镀银碳纤维；波形；烟粉虱

刺吸电位技术(Electrical Penetration Graph，EPG)是用于记录刺吸式口器昆虫口针在寄主组织中刺探和取食行为电信号变化特征的技术。主要用于刺吸式口器昆虫取食和传毒行为的研究，也用于植物抗虫机制的分析、内吸性农药的测定、昆虫取食刺激物或抑制剂的定位等方面的研究[1,2]。这一技术出现后在实践中已得到了多次改进[3-7]，尤其是将EPG技术与计算机联用后，明显扩大了EPG的应用范围，提高了分析效率。然而，连接昆虫与电极之间的导电金丝多年来一直依靠进口，且金丝韧性随着其直径的减小也逐渐变弱，在一定程度上制约了EPG的普及和应用，因而有必要寻找替代金丝的材料。碳纤维(Carbon fiber)是一种具有较高强度和拉伸模量(Tensile modulus)的材料，它不仅具有碳材料的固有特性，又兼具纺织纤维的柔软可加工性，是新一代增强纤维。每一根碳纤维由数千条直径大约5～8 μm的更微小碳纤维组成[8]。银具有导电性好、抗氧化能力强、化学性能稳定等优点[9]，相对于进口金丝，银的价格相对较低。因此，本研究利用镀银碳纤维代替金丝粘连昆虫，通过EPG记录进行对比，试图获得更为精确的EPG波形和更廉价的导电金丝替代品，为深入研究刺吸式口器昆虫取食行为，特别是为传毒机理研究所需要的波形精细变化做出一定的探索尝试。

1 材料与方法

1.1 供试材料

黄瓜CucumissativusL.,cv品种为绿剑一号，在光周期L16∶D8；温度(28±0.5)℃；相对湿度(75±0.5)%的温室中培养。当黄瓜长至3～4片真叶时用于试验。Q型烟粉虱Bemisiatabaci在室内饲养笼(60 cm×40 cm×80 cm)内的黄瓜(品种为绿剑一号)上标准化饲养多年，定期用mtCOI标记检测烟粉虱种群的生物型纯度[10,11]。EPG测定时随机选取新羽化的烟粉虱雌性成虫用于试验。

导电金丝(直径12.5 μm)购自荷兰瓦赫宁根大学；碳纤维(单根纤维丝直径5～8 μm)购于日本东丽株式会社，化学镀银试剂均为市售化学纯。

1.2 碳纤维镀银

将碳纤维通过去胶、除油、粗化、敏化和活化后，放入银盐溶液中进行化学镀银[12,13]。银盐溶液：硝酸银(AgNO3)3.5 g，氨水(NH3·H2O)5 mL，蒸馏水60 mL，氢氧化钠(NaOH)2.5 g；还原剂溶液：葡萄糖(C6H12O6)45 g，酒石酸(C4H6O6)4 g，乙醇(CH3CH2OH)100 mL，蒸馏水1 L[14,15]。以上2种反应液均现用现配。镀覆完成后用去离子水清洗碳纤维丝，自然晾干。

1.3 EPG记录

试验分别用镀银碳纤维和金丝作为导电材料。在进行EPG测定前，测量镀银碳纤维和金的电阻(导电性)，分别为14.2 Ω·cm-1和1.6 Ω·cm-1。导电银胶为河南农业大学化学生态实验室配制(专利授权号ZL201010610889)。

测定EPG时，取1.5～3.0 cm长的镀银碳纤维或金丝用导电银胶粘连到烟粉虱的前胸背板上，将粘连好的烟粉虱饥饿20 min，随机选取活力较强的个体放在黄瓜叶片的背面取食[16]。EPG探头摄取电信号通过放大器放大后，由A/D转换器收集并转换，再经Windaq软件(DATAQ instruments)在电脑上显示波形。每次记录均使用新的植物和烟粉虱，试验持续记录6 h。所有的试验均在温度(28±0.5)℃、相对湿度(70±0.5)%、光照良好的法拉第笼(屏蔽环境中电磁干扰)中完成。

1.4 数据分析

对所记录的Pd波、E1波和E2波的电压水平、相对振幅、频率等进行分析。其中Pd波(胞内刺探波，Intracellular penetration)表示昆虫口针刺入组织细胞并从中抽样取食的过程，E1波(韧皮部唾液分泌波，Phloem salivation phase)表示昆虫口针在韧皮部筛分子内部分泌唾液的行为，E2波(韧皮部取食波，Phloem ingestion phase)表示昆虫被动吸食韧皮部汁液的行为，相对振幅以整个波形最高振幅为100进行折算[17]，频率为每秒波动的次数。

使用SPSS21.0软件进行数据统计分析。采用多重比较Tukey’s新复极差法对2个处理进行比较分析，差异性显著水平设置为P<0.05或P<0.01。

2 结果与分析

2.1 整体波形对比

比较镀银碳纤维和金丝记录烟粉虱在黄瓜上的取食波形可以发现，两者记录的DC-EPG波形非常相似(图1-A，图1-B)。烟粉虱在黄瓜叶片上的非刺探波与基线重叠，波动频率为零；刺探波频率类似，均为正压，但与金丝记录波形相比，镀银碳纤维记录的波形振幅相对较小；胞内刺探波(pd)和韧皮部取食波(E1波和E2波)变化相似，均为负压。

A. 金丝记录的波形; B. 镀银碳纤维记录的波形; C. 金丝记录的pd波; D. 镀银碳纤维记录的pd波; E. 金丝记录的E1波; F. 镀银碳纤维记录的E1波; G. 金丝记录的E2波; H. 镀银碳纤维记录的E2波。

A. Waveforms recorded with gold wire; B. Waveforms recorded with silver plated carbon fiber; C. pd waveform recorded with gold wire; D. pd waveform recorded with silver plated carbon fiber; E. E1 waveform recorded with gold wire; F. E1 waveform recorded with silver plated carbon fiber; G. E2 waveform recorded with gold wire; H. E2 waveform recorded with silver plated carbon fiber.

图1 镀银碳纤维和金丝记录的Q型烟粉虱EPG波形比较
Fig.1 DC-EPG waveforms of Q biotypy Bemisia tabaci recorded by using silver-plated carbon fiber and gold wire

2.2 pd波比较

镀银碳纤维记录的pd波相对振幅较金丝记录的显著低(镀银碳纤维电压为7.50 V，金丝电压为9.74 V；P=0.011)，而两者记录波形的频率差异不显著(镀银碳纤维频率为16.42 Hz，金丝频率为13.81 Hz；P=0.060)。pd波又分为pd-Ⅰ亚波、 pd-Ⅱ亚波和 pd-Ⅲ亚波，其中负压亚波pd-Ⅱ又分为Ⅱ-1、Ⅱ-2和Ⅱ-3。图1(图1-C，图1-D)中pd亚波相比，镀银碳纤维记录波形的相对振幅较金丝的均显著低；而除了Ⅱ-2亚波，镀银碳纤维记录波形频率较金丝记录的均显著高(P<0.05)。除此之外，镀银碳纤维记录的pd波(pd、Ⅱ-1、Ⅱ-2、Ⅱ-3)电压水平较金丝记录的均极显著低(P=0.002)。

表1 使用金丝和镀银碳纤维所获得的DC-EPG波形特征比较Table 1 Characteristics of DC-EPG waveforms with gold wire and silver-plated carbon fiber

注：相对振幅是以完整波形最高振幅为100计算；频率为每秒波动次数；*表示显著性差异(Tukey’s testP<0.05)，** 表示极显著性差异(Tukey’s testP<0.01)。

Note：Relative amplitude was calculated by the maximum amplitude of whole waveform as 100; rate (Hz) was the frequency of wave numbers per second; * and ** indicate significant difference at level ofP<0.05 andP<0.01(Tukey’s test), respectively.

2.3 E波比较

镀银碳纤维记录E波(E1，E2)的相对振幅和金丝记录的差异均不显著(P>0.05)。两者记录的E1波电压水平差异不显著(镀银碳纤维电压为0.33 V，金丝电压为0.76 V；P>0.05)，但镀银碳纤维记录的E2波电压水平显著低于金丝的记录(镀银碳纤维电压为0.22 V，金丝电压为0.73 V；P<0.05)。

3 讨论

刺探行为是刺吸式口器昆虫选择寄主的重要活动，刺探过程是从昆虫口针与植物表面的接触开始，最后穿刺到达韧皮部取食。EPG波形可以反映出刺吸式口器昆虫对寄主植物的接受程度[18]。使用镀银碳纤维记录烟粉虱在黄瓜上的取食波形显示，其波形频率较金丝记录水平有所提高，而振幅和电压水平相对较低，这可能是镀银碳纤维的电阻值(14.2 Ω·cm-1)大于导电金丝的电阻值(1.6 Ω·cm-1)所致，有待进一步探明。

昆虫介体传播植物病毒与其取食过程中口针刺破细胞膜的行为有关[19,20]。由于介体传毒时必须将病毒分泌到植物的活细胞内病毒才能存活，同时昆虫获取病毒亦需要从细胞或韧皮部吸食时进行，因此，穿刺细胞的pd波和韧皮部波形(E1波和E2波) 对非持久性病毒的传播尤为重要。POWEL[21]发现pd波的出现与桃蚜成功传播马铃薯 Y 病毒有关。pd 波是昆虫在植物表皮层细胞的试探性取食时刺破细胞膜而产生的，pd波又可分为pd-Ⅰ、pd-Ⅱ和 pd-Ⅲ共3个部分，其中 pd-Ⅱ亚波又可细分为Ⅱ-1、Ⅱ-2和Ⅱ-3，pd-Ⅱ亚波与介体获毒和接种病毒有关，蚜虫的获毒过程发生在 pd-Ⅱ亚波的Ⅱ-3阶段(取食) ，接种病毒过程发生在Ⅱ-1和Ⅱ-2阶段(分泌唾液)[19,21]。因此，利用镀银碳纤维获得精确度更高的波形，将有助于深入研究介体的传毒过程。镀银碳纤维和金丝记录的pd波，尤其是pd-Ⅱ亚波的波形相似度很高，而镀银碳纤维记录的波形频率有所提高，振幅却相对较小(表1)。但这并不影响对pd波形的分析。LIU等[22]发现Q型烟粉虱在带毒植物上有更多的取食行为。JIANG等[23]研究发现烟粉虱传播番茄花叶病毒病的效率与E1波出现的次数和E1波持续的时间有关，带毒烟粉虱的刺探次数和E1波持续时间明显增多。利用改进后的EPG波形进行介体传播植物病毒与取食行为关系的研究，通过分析更为精确的波形，可能会更加有助于阐明介体的传毒机理。

碳纤维不但具有很高的强度和拉伸模量，还有很强的柔韧性。相对于使用金丝，用镀银碳纤维粘连的烟粉虱能更加自由地活动，也就是使用镀银碳纤维对昆虫限制较小，EPG所记录的取食行为更能够反应实际情况。在昆虫的粘接过程中，导电丝端部银球的大小、形成难易程度，对试验顺利进行至关重要。而镀银碳纤维相对导电金丝端部能更好地形成银球，较容易粘连昆虫，这可能与镀银材料表面较为粗糙有关。试验证明，使用镀银碳纤维粘连昆虫能提高试验效率，同时有助于初学者掌握粘连昆虫的技巧。目前使用镀银碳纤维在一定程度上改善了EPG波形的精确度，提高了试验的效率，但导电性还是相对较低，需要加以改进才能推广应用，比如，还有一些化学镀银工艺需要优化，如控制化学镀银过程的温度和时间，银盐溶液和还原剂溶液的用量，提高镀层结合力和均匀性等。

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(责任编辑：蒋国良)

Application of silver-plated carbon fiber in the electrical penetration graph recordings ofBemisiatabaci

LU Shaohua1， PAN Jianbin2, SONG Xi1, YAN Fengming1

(1.College of Plant Protection, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2.College of Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

In order to explore possible application of the cheaper, new material in Electrical Penetration Graph (EPG) experiments, in this study, waveforms of Q biotypeBemisiatabacifeeding behavior in direct-current electrical penetration graph (DC-EPG) were recorded and compared by parallel using of the silver-plated carbon fiber and the golden wire. The results showed that the EPG-recorded waveforms with silver-plated carbon fiber were almost similar to those with golden wire. By comparatively analyzing typical waveforms, it is found that the waveforms with silver-plated carbon fiber had lower relative amplitude than those with the golden wire.Ⅱ-1 and Ⅱ-3, sub-waveforms of waveform potential drops (pd), differently higher frequency was observed. The waveform E2 in recordings using silver-plated carbon fiber had significantly lower voltage levels compared with those recordings with golden wire, but for waveform E1, there were no significant differences in relative amplitudes, frequencies and the voltage levels between both recordings. The results indicated that silver-plated carbon fiber could be used to replace gold wire in the EPG recordings to obtain more precise waveforms, but there is still some space for improvement of the electrical conductivity.

EPG; golden wire; silver-plated carbon fiber; waveforms;Bemisiatabaci

2014-11-03

国家自然科学基金项目(31471776)

卢少华(1988-)，男，河南周口人，硕士研究生，主要从事烟粉虱传毒机理研究。

闫凤鸣(1962-)，男，河南商丘人，教授，博士研究生导师。

1000-2340(2015)02-0229-05

Q967

A