湖北部分地区规模化蛋鸡场H9亚型禽流感疫苗免疫效果调查

汪招雄，欧阳金旭，杨玉莹，张平英，程太平，卢文婷

（1.长江大学动物科学学院，湖北荆州434025；2.湖北省荆州市畜牧兽医局，湖北荆州434100）

禽流感是由A型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的一种急性传染病，病毒毒力较强时鸡群可表现严重的全身性、出血性、败血性症状，病死率较高；毒力弱时鸡群表现为轻度的呼吸道或消化道症状，病死率较低。禽流感病毒不仅威胁禽类的健康，也威胁人类健康，具有重要的公共卫生学意义。世界动物卫生组织（WHO）将禽流感列为必须报告的动物传染病，我国将其列为一类动物疫病。在我国，高致病性禽流感以H5N1亚型为代表，低致病性禽流感以H9N2亚型为主。

1994年我国首次从广东省鸡场中分离到第一株H9N2亚型禽流感病毒，此后，该亚型禽流感病毒迅速向临近省份蔓延。随着H9N2亚型灭活疫苗在我国广泛应用，该病在一定程度上得到有效的控制。然而，在部分地区，由于防疫意识不高、免疫程序不合理，该病毒在部分蛋鸡场仍然时有发生，导致鸡群出现呼吸道症状，产蛋率下降，鸡蛋品质严重下降。本研究从湖北省不同地区随机采集不同日龄蛋鸡样本，监测H9N2亚型禽流感疫苗免疫效果，以期制定符合当地鸡群的防控H9N2亚型禽流感免疫程序，减少疫情发生几率。

1 材料与方法

1.1 材料

H9N2亚型禽流感病毒血凝抑制试验标准抗原（生产批号：201305）、阳性血清，中国哈尔滨维科生物技术开发公司产品；8.5g／L生理盐水作为稀释液，红细胞保存液（PBS液），38g／L柠檬酸钠抗凝剂。

1.2 方法

1.2.1 血液血液采集及血清制备 对湖北不同地区（公安、京山、沙洋、天门、浠水、仙桃、襄阳区、孝感、应城、枣阳）规模蛋鸡场的鸡随机采血，每只翅下静脉采血2mL，共采集血样1 631份。采集血样静置1h，待血清析出后，3 000r／min离心5min，取上层血清待检。

1.2.2 10mL／L红细胞悬液制备 用一次性注射器随机采取健康非免疫公鸡血液，放入加有抗凝剂的离心管中，抗凝剂与全血的比例约为1∶2左右，迅速混匀。然后放入离心机中以3 000r／min离心5 min，吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，再次在离心管中加生理盐水，慢慢混合均匀，3 000 r／min离心5min，弃去上清液，按照上述方法反复操作4次～5次，直到上清液澄清透明，最后一次离心后的红细胞，弃去上清液，即为红细胞泥。放入4.0℃冰箱中可保存2d～3d。每次抗体检测时吸取0.1mL红细胞泥，加入9.9mL的生理盐水，即为10mL／L红细胞悬液。注意红细胞悬液要现用现配，使用前需要观察红细胞是否变质。

1.2.3 4单位抗原配制 取出冻干的浓缩抗原，加入2mL～3mL生理盐水稀释融化后，测其抗原效价，能够完全引起血凝的病毒最高稀释度视作抗原的效价，此稀释度为1个HA单位抗原，以此稀释度配制4个HA单位抗原。

1.2.4 待检样品测定 根据血凝抑制试验的方法及操作规范对血清样品进行检测，设置阴性和阳性对照。

2 结果

2.1 不同月份蛋鸡场样本H9N2亚型禽流感病毒抗体效价分析

按照不同月份，分别对2013年6月至12月蛋鸡血清1 631份进行H9N2亚型禽流感病毒抗体检测，抗体滴度检测结果见表1和表2。

由表1可以看到，所有样本中，10月份H9N2亚型禽流感平均抗体滴度最高，达到9.55log2，8月份平均抗体滴度最低，为8.71log2。6、7、9、11、12月份平均抗体滴度介于两者之间。

从表1、表2中可以看出各个月份血样中禽流感病毒H9亚型抗体合格率（≥6）最低的是8月份，为88.1%，9月稍高，为94.3%，抗体滴度最高的是7月份，为100.0%，其他各月平均抗体滴度介于8月和7月之间；优秀率（≧9）最低的是9月份，为73.8%，最高的是10月份，为90.7%，其他各月介于这二者之间。其中8月份和9月份的优秀率要明显低于其他几个月。

表1 规模化蛋鸡场不同月份H9N2亚型禽流感病毒抗体效价Table 1 The antibody titers of H9N2subtype AIV from layer farms in different months

2.2 不同地区蛋鸡场样本H9N2亚型禽流感病毒抗体效价分析

对10个不同地区样本H9N2亚型禽流感病毒抗体抗体滴度检测结果见表3和表4。

表2 规模化蛋鸡场不同月份H9N2亚型亚型禽流感抗体效价合格率和优秀率Table 2 The qualified and excellent rates of antibody titers of H9N2subtype AIV from layer farms in different months

表3 规模化蛋鸡场不同地区H9N2亚型禽流感病毒抗体效价Table 3 The antibody titers of H9N2subtype AIV from layer farms in different areas

根据表3显示，湖北省不同地区样本中，抗体滴度平均值最低的来源于沙洋，H9N2亚型禽流感病毒抗体效价平均为7.94log2，抗体整齐度差，差值相差较大；抗体滴度最高的是来源于浠水的蛋鸡样本，H9N2亚型禽流感病毒抗体效价平均为9.88log2，其他各个地区蛋鸡血样的抗体效价平均值介于这二者之间。除了沙洋蛋鸡样本外，其他各个地区的H9N2亚型禽流感病毒抗体效价平均滴度值均在9.00log2以上。

表4 规模化蛋鸡场不同地区H9N2亚型禽流感抗体效价合格率和优秀率Table 4 The qualified and excellent rates of antibody titers of H9N2subtype AIV from layer farms in different areas

从表4中可以看出各个地区采集来的血液样本中，来源于沙洋血样中H9N2亚型禽流感病毒抗体合格率（≥6）最低，为80.0%，合格率最高的是来源于浠水的血样，为100.0%，其他各个地区的血液样本的合格率介于这两者之间。而来源于京山，沙洋，应城和枣阳的样本中H9N2亚型禽流感病毒抗体优秀率（≥9）均低于80.0%。

2.3 不同日龄蛋鸡H9N2亚型禽流感病毒抗体效价分析

对不同日龄蛋鸡样本H9N2亚型禽流感病毒抗体效价分析结果见表5、表6。

由表5可以看到，不同日龄蛋鸡血液样本中，日龄小于等于105d的样本H9N2亚型禽流感抗平均滴度值最低，为9.08log2，随着日龄的不断上长，样本的H9N2亚型禽流感抗平均滴度值不断上升。

从表6中可以看到不同日龄蛋鸡的样本H9N2亚型禽流感病毒抗体合格率均在90.0%以上，而在蛋鸡日龄小于等于105d时的这段时间，H9N2亚型禽流感病毒抗体优秀率为74.6%，明显低于其他日龄蛋鸡的血液样本，而在蛋鸡日龄在105d和300d之间，H9N2亚型禽流感病毒抗体滴度大于等于9的比例不超过81.2%。

表5 不同日龄蛋鸡H9N2亚型禽流感病毒抗体效价Table 5 The antibody titers of H9N2subtype AIV from different day age layers

表6 不同日龄蛋鸡H9N2亚型禽流感病毒抗体效价合格率和优秀率Table 6 The qualified and excellent rates of antibody titers of H9N2subtype AIV from different day age layers

3 讨论

历时7个月对湖北省规模化蛋鸡场鸡群禽流感病毒灭活疫苗免疫抗体水平进行了检测，结果显示，在不同区域，整体上H9N2亚型禽流感疫苗的免疫效果良好，基本可以保护蛋鸡群免受同型病毒的感染。该免疫效果与其免疫时所用的单价苗及接种时间的合理选择有着必不可分的联系。因为单价苗的纯度较高，而且减少了其他疫苗的干扰，使得机体能够产生大量的抗体，同时合理的接种时间也有效的维持了高抗体的时长。

但是检测结果还显示，相较于其他几个月检测样本，8月份和9月份样本平均抗体效价均偏低，原因和可能和天气炎热有关系。一方面天气炎热会引起鸡体产生较强的应激反应，影响疫苗免疫效果，另一方面天气炎热季节会造成部分养殖企业减低疫苗密度、延长H9N2亚型禽流感疫苗免疫时间。因此，养殖企业要在夏季做好降温措施，尽量降低蛋鸡群机体的免疫应激反应，同时保证鸡群对H9N2亚型禽流感合理的免疫密度显得尤为重要。

在不同地区，蛋鸡在接种H9N2亚型禽流感疫苗后免疫效果存在一定的差异，导致该现象的原因可能与各地的免疫程序和选择的疫苗有很大的关系。由于各个地方蛋鸡场养殖习惯不一样，养殖水平存在一定的差异，免疫程序、免疫途径、免疫剂量和所免疫的疫苗也存在差异。因此，建议养殖者根据最近几年病原流行的变化调整免疫程序，及时进行抗体监测，提高这些地区鸡群康H9N2亚型禽流感病毒抗体水平。

对不同日龄蛋鸡的样本H9N2亚型禽流感病毒抗体进行分析显示，加强免疫能够明显提高免疫效果。但是在蛋鸡日龄在105～200之间，部分鸡群抗体滴度值小于4log2，并且存在抗体滴度离散度大，极差大的特点，这提示在鸡群进入产蛋后部分鸡场免疫仍存在免疫不均、免疫程序不合理的漏洞，值得引起警示。在蛋鸡日龄在105d和300d之间，H9N2亚型禽流感病毒抗体滴度大于等于9的比例不超过81.2%，还存在较大的提升空间。

［1］金爱华，沈 强，余红梅，等.H9亚型禽流感流行病学调查［J］.上海畜牧兽医通讯，2012（3）：36-37.

［2］孙泉云.H9N2亚型禽流感流行状况的研究进展［J］.动物医学进展，2011，32（10）：107-111.

［3］葛菲菲.2007年-2008年上海市H9N2亚型禽流感病毒的遗传演化［J］.中国人兽共患病学报，2011（8）：696-699.

［4］刘国乾，曹 蓝，和 君，等.三株H9N2亚型禽流感病毒全基因组序列分析［J］.动物医学进展，2012，33（5）：1-7.

［5］肖月蕊，颜瑞萍，李明义，等.H9N2亚型禽流感重组病毒的拯救［J］.动物医学进展，2014，35（10）：20-26.

［6］熊江林，周华林，王长义，等.鄂西北地区规模化鸡场H9亚型禽流感抗体水平监测［J］.中国畜牧兽医，2010，37（12）：239-341.

［7］孙惠霞，宋金祥.当前应重视强毒新城疫和H9亚型禽流感的防控［J］.北方牧业，2012（14）：19.

［8］曹立辉，李秀英，王 辉，等.商品蛋鸡H9亚型禽流感混合感染概述［J］.北方牧业，2012（19）：22.

［9］Yuan J，Xu L，Bao L，et al.Characterization of an H9N2avian influenza virus from aFringillamontifringillabrambling in northern China［J］.Virology，2015，476：289-297.

［10］Zhang W，Xu H，Meng F，et al.Evolution of H9N2influenza viruses isolated in Shandong Province［J］.Sci China Life Sci，2015，58（2）：212-214.

［11］Jin Y，Yu D，Ren H，et al.Phylogeography of avian influenza A H9N2in China［J］.BMC Genomics，2014，15（1）：1110-1120

［12］Sun Y，Liu J.H9N2influenza virus in China：a cause of concern［J］.Protein Cell，2015，6（1）：18-25.