STAT3在新型肠道病毒71型(EV71)感染和复制中的作用初步研究

王 艳 卞 良 刘晴晴 熊 鹰 李泽阳 龙健儿

(复旦大学基础医学院病原生物学系 上海 200032)

STAT3在新型肠道病毒71型(EV71)感染和复制中的作用初步研究

王 艳 卞 良 刘晴晴 熊 鹰 李泽阳 龙健儿△

(复旦大学基础医学院病原生物学系 上海 200032)

目的 研究STAT3(signal transducer and activator of transcription 3)对新型肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)感染及复制的影响。方法 观察EV71感染横纹肌肉瘤细胞后STAT3的动态表达;利用慢病毒载体下调或过表达STAT3技术,观察细胞在改变STAT3表达后,对EV71感染细胞后病毒VP1表达、形成蚀斑和病毒滴度的影响,研究STAT3对EV71感染和复制的影响。结果 EV71感染可明显下调细胞STAT3-Tyr705磷酸化(p-STAT3)水平。在STAT3表达稳定下调的细胞中,p-STAT3水平也下调,这有利于EV71病毒感染和复制。而过表达STAT3的细胞内,p-STAT3水平也上调,对EV71感染和复制的效应与上述STAT3下调的结果相反。免疫共聚焦和蚀斑分析发现高表达p-STAT3的细胞不易被EV71感染。结论EV71感染可明显下调p-STAT3水平,并促进病毒的复制。STAT3影响EV71的感染和复制,可能主要通过STAT3的磷酸化水平影响细胞对病毒的易感性。

EV71; STAT3; 横纹肌肉瘤细胞

肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)是导致婴幼儿手足口病及神经系统并发症的主要病原体,目前尚无有效的疫苗和特异性抗病毒药物[1-5]。因此,加强EV71与宿主相互作用的基础研究显得非常重要。研究表明,EV71感染诱导宿主细胞因子风暴(cytokine storm)和细胞凋亡可能与其导致神经性重症相关[1-2,6]。EV71诱生一些致炎症因子,如COX2、VCAM-1、TNF-α等通过激活C-Src(sarcoma kinase)、PDGFR (platelet-derived growth factor)、EGFR、PI3K/AKT、MAPK和NF-κB等信号通路[7-10]来表达;而PDGFR,EGFR,PI3K/AKT,NF-κB等分子可能与STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3)分子在信号传递的多个层次上相互作用,形成正向或反向、直接或反馈的调控[11-14]。STAT3还能拮抗STAT1、STAT4等介导的Th1型细胞因子(如IL-12,IFN-γ)的释放,调节Treg、Th1、Th17等辅助T细胞的发育和分化等[13,15-16]。此外,STAT3可通过Fas、BCL-XL及BCL-2等基因参与细胞凋亡过程[11]。因此,作为中轴性信号转导分子,STAT3在病毒感染、细胞免疫应答、细胞生长发育和凋亡等多个环节起着重要的调节作用。

然而,STAT3在病毒感染和复制中的作用尚不明确,有研究表明STAT3影响多种病毒的感染和复制,如SARS-CoV、VZV、HCV和HBV等[17-20]。研究发现,pY705-STAT3 (p-STAT3)在VZV、HCV和HBV等病毒感染后上调,并促进上述病毒的复制。而在Vero E6细胞中,p-STAT3在SARS-CoV感染后下调;在B细胞中,低水平的p-STAT3有利于激活EBV裂解细胞[21]。显然STAT3对病毒感染和复制的影响是一个病毒特异性生物学过程。至于STAT3是否在EV71的感染和复制中发挥重要作用目前并不清楚。因此,本研究拟通过观察EV71感染细胞后STAT3的动态变化,构建过表达STAT3细胞株及STAT3稳定沉默细胞株,以研究STAT3对EV71感染和复制的影响。

材 料 和 方 法

材料和试剂 EV71病毒株(Genbank Access No.HQ891927,064-Shanghai)由本实验室分离并保存[22]。横纹肌肉瘤(rhabdomysarcoma,RD)细胞购自中科院细胞库。慢病毒过表达载体pCDH-puro和基因沉默载体pLKO.1-puro系统分别为美国SBI和Addgene公司产品。

构建稳定下调或过表达STAT3的RD细胞 为构建稳定下调STAT3表达细胞,通过设计与人类STAT3 mRNA (NM_139276.2) 1 578～1 598位点靶向结合的短发卡RNA(short hairpin,shRNA)。将shRNA克隆入慢病毒载体pLKO.1,与病毒包装质粒pspAX2,pMD2.G共转染RD细胞,包装有感染性的病毒。用包装好的慢病毒感染RD细胞,通过嘌呤霉素(2 μg/mL)筛选稳定整合慢病毒的细胞株RD-pLKO.1-shSTAT3。提取细胞基因组DNA经PCR进一步确认病毒整合情况。为构建过表达STAT3细胞,将STAT3 cDNA (位于133～2 396,NM_213662)克隆入慢病毒载体pCDH-puro中,按照上述类似方法包装有感染性的慢病毒,然后用嘌呤霉素筛选稳定细胞株(RD-pCDH-STAT3-puro)。同时分别构建和筛选整合阴性对照慢病毒载体pLKO.1-SCR及pCDH-puro的RD细胞作为对照。

免疫荧光染色 为确定STAT3对病毒感染的作用,将上述整合不同慢病毒的RD细胞接种于6孔板(6×105/孔),孵育24 h后感染EV71 (MOI=1.0 PFU/细胞)。2 h后弃去病毒上清,重新加入2 mL新鲜培养基。感染后6 h,细胞经4%甲醛固定、甲醇穿透之后与VP1单抗(1∶1 000稀释)和山羊抗鼠IgG-DyLight 594(1∶500稀释)反应。最后用DAPI染色,在EVOS F1荧光显微镜下观察;或同时以p-STAT3单抗(1∶100稀释)和山羊抗兔IgG-Alexa FluorTM488染色。最后经DAPI着染,细胞免疫荧光经共聚焦显微镜观察。

MTT法检测细胞存活力 为确定STAT3表达改变后EV71感染如何影响细胞存活力,将整合不同慢病毒的RD细胞接种在96孔板(2×104/孔)中,孵育24h后,EV71以不同的MOI感染细胞(从MOI=10 PFU/细胞开始2倍连续稀释)。细胞孵育24～72 h后,随后加入MTT(10 μL/孔)反应4 h,再加入DMSO (200 μL/孔)于37 ℃裂解15 min,并测定细胞570 nm处的吸光度(D)值。病毒感染后细胞的存活力百分数以DEV71-infected/Dcell control×100%表示。

EV71蚀斑形成分析 将RD细胞接种于6孔板(1×106/孔),孵育24 h。之后EV71按梯度稀释感染RD细胞2 h,弃去病毒上清后用PBS洗3遍,然后用2 mL含2% FBS及0.5%低熔点琼脂糖的新鲜培养基覆盖并孵育72 h。用0.1%的中性红染色4～6 h后观察蚀斑形成情况。为确定STAT3对EV71形成蚀斑能力的影响,将整合不同慢病毒的RD细胞分别接种于6孔板,然后用相同病毒储存液(经正常RD细胞测定后病毒滴度为4.8×107PFU/mL)经指定倍数稀释,分别用0.5 mL病毒稀释液感染不同细胞2 h,按上述方法检测EV71在不同细胞上形成蚀斑的数量和大小。

数据统计分析 不同组间的数据使用Student′st检验进行数据分析,所有数据均使用SPSS 11.0软件进行处理。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

EV71对STAT3表达的影响 EV71感染细胞后30和45 min,STAT3磷酸化(p-STAT3)水平分别下调1.86和3.14倍,并长时间持续下降(图1A)。而总STAT3的表达在EV71感染后无显著变化(图1B)。结果表明EV71感染可迅速下调p-STAT3的水平,而对总STAT3的表达无显著影响。

p-STAT3与EV71感染的关系 为研究p-STAT3与EV71感染的关系,我们利用免疫荧光染色和共聚焦显微镜观察,发现在EV71感染早期(6 h,MOI=1 PFU/细胞),高水平p-STAT3表达的细胞(强绿色荧光)通常不易被EV71感染、几乎看不到VP1染色信号(红色荧光);而被EV71感染,VP1染色信号强的细胞,其p-STAT3的水平通常较低(图2)。提示细胞高表达p-STAT3可能抑制了EV71的感染。

下调STAT3可促进EV71的感染和复制 为确定STAT3及p-STAT3在EV71感染和复制中的作用,我们采用shRNA下调STAT3和p-STAT3的方法,通过构建相应的慢病毒载体、筛选稳定下调STAT3的细胞株RD-pLKO.1-shSTAT3(图3A)。在稳定细胞株中,STAT3 mRNA、总STAT3及p-STAT3与对照细胞株RD-pLKO.1-SCR相比均明显下调(图3B)。在EV71感染后的8 h,免疫荧光染色显示RD-pLKO.1-shSTAT3细胞中VP1信号高于对照组RD-pLKO.1-SCR细胞(图3C)。EV71在不同MOI条件下感染细胞,细胞存活力随MOI的增加而下降,RD-pLKO.1-shSTAT3细胞存活力较对照RD-pLKO.1-SCR细胞下降更快,并且下降的幅度随着病毒感染时间延长至42～72 h而更为明显(图3D)。比较两种细胞EV71蚀斑形成情况,结果显示RD-pLKO.1-shSTAT3细胞形成的蚀斑大于对照组RD-pLKO.1-SCR细胞,且边缘较清晰;形成的蚀斑数量在等量病毒、相同感染时段较对照组增加2.92倍(图3E)。提示下调STAT3和p-STAT3水平使细胞对EV71更敏感,显著恢复了RD细胞由于整合pLKO.1慢病毒载体后而丧失的部分对EV71的敏感性(病毒储存液在RD-pLKO.1-SCR上形成的蚀斑数明显少于正常RD细胞,结果未统计)。观察EV71感染RD-pLKO.1-shSTAT3细胞后病毒的复制情况,结果显示在感染后8～24 h,EV71 VP1在RD-pLKO.1-shSTAT3细胞中的表达与对照相比,可更早地检测到,且表达量明显更高(图3F),同时上清液中病毒滴度在感染后4～24 h均明显高于对照组(P<0.05,图3G)。上述结果提示下调STAT3和p-STAT3水平可增加细胞对EV71的易感性,进而促进病毒的感染和复制。

图1 EV71感染RD细胞后p-STAT3和STAT3的表达Fig 1 Expressions of p-STAT3 and STAT3 after EV71 infected RD cells

图2 免疫荧光染色观察EV71感染细胞后VP1和p-STAT3的表达(×200)Fig 2 Immunofluorescence staining of VP1 and p-STAT3 in cells after EV71 infection (×200)

过表达STAT3抑制EV71的感染和复制 为进一步确认STAT3对病毒感染的作用,将STAT3基因克隆并包装进入慢病毒载体pCDH-STAT3-puro,进而筛选稳定表达的细胞株RD-pCDH-STAT3-puro(图4A)。在稳定细胞株中,STAT3 mRNA上调了3.68倍,总STAT3和p-STAT3较对照组RD-pCDH-puro分别上调了2.41倍和1.97倍(图4B)。利用此RD-pCDH-STAT3-puro细胞检测过表达STAT3对EV71感染和复制的影响:在EV71感染细胞后8h,免疫荧光染色初步显示RD-pCDH-STAT3-puro细胞中VP1信号弱于对照组RD-pCDH-puro细胞(图4C);病毒以不同的MOI复数感染细胞之后,随着MOI的增加,RD-pCDH-STAT3-puro和对照组RD-pCDH-puro细胞的存活力均明显下降,但RD-pCDH-STAT3-puro较对照组下降更慢。当病毒感染至48 h时,RD-pCDH-STAT3-puro细胞存活力比对照组下降的幅度也更小(图4D)。比较EV71感染两种细胞株的蚀斑形成情况,发现等量病毒在相同的感染时间内,RD-pCDH-STAT3-puro细胞形成的蚀斑数量约为对照组RD-pCDH-puro细胞的81%(图4E)。观察EV71的复制情况,发现RD-pCDH-STAT3-puro细胞中EV71 VP1的表达在感染后8～24 h低于对照组(图4F),且上清中病毒滴度在感染后8～24 h也明显低于对照组(P<0.05,图4G)。上述结果说明,过表达STAT3和高水平的p-STAT3降低了细胞对EV71的易感性,并不利于EV71的感染和复制。

讨 论

STAT3可影响多种病毒的复制过程,有研究显示HCV核心蛋白可直接与STAT3相互作用并激活STAT3。研究发现在HCV复制时STAT3被持续地磷酸化,且STAT3的活化可显著促进HCV的复制。由于STAT3是转录因子,研究发现STAT3可能通过正向调控微管动力蛋白而影响HCV的复制过程[19]。HBV的X蛋白(HBx)在病毒复制及诱导肝细胞肿瘤过程中发挥重要作用。Waris等[20]发现,HBx可与线粒体结合并诱导一些转录因子(如STAT3和NF-κB活化)。另有研究发现,带状疱疹病毒感染可导致细胞STAT3的磷酸化,而磷酸化抑制剂可抑制体外VZV的复制,显著减小由VZV感染导致的皮肤损伤[18]。

图3 STAT-3表达下调促进EV71的感染和复制Fig 3 STAT-3 knock-down stimulated EV71 infection

图4 STAT-3过表达抑制EV71的感染和复制Fig 4 STAT-3 overexpression inhibited EV71 infection

STAT3在病毒复制中的作用十分复杂,如p-STAT3在上述病毒如HCV、HBV和VZV感染后上调,并促进病毒的复制,而在Vero E6细胞中p-STAT3在SARS-CoV感染后下调[17],这与本研究EV71感染后使细胞p-STAT3下调类似。此外,在B细胞中低水平的p-STAT3有利于激活EBV裂解细胞[21],而IL-6诱导的STAT-3磷酸化和入核过程也被人偏肺病毒(human metapneumovirus)感染所抑制[23]。显然,宿主细胞STAT3影响病毒复制是一个对病毒特异的应答过程。

在本研究中,我们发现了STAT3与EV71的感染和复制有关。EV71感染可以明显抑制STAT3的磷酸化,而高水平p-STAT3抑制了EV71的感染。下调STAT3可以促进病毒增殖,而过表达STAT3则抑制病毒复制。结合共聚焦显微镜观察EV71感染细胞早期p-STAT3和VP1的分布及等量病毒在相同感染时间内形成的蚀斑,提示细胞STAT3影响EV71感染和复制可能主要通过p-STAT3水平来影响细胞对EV71的敏感性,进而影响EV71的复制。至于STAT-3影响EV71感染和复制的分子机制,以及EV71又如何下调宿主细胞p-STAT3水平而拮抗细胞的抗病毒能力,尚需进一步研究。明确STAT3和EV71感染和复制的关系有利于加深对EV71致病机制的理解,并为研究抗EV71感染药物提供线索。

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Effects of STAT3 on enterovirus 71 (EV71) infection and replication

WANG Yan, BIAN Liang, LIU Qing-qing, XIONG Ying, LI Ze-yang, LONG Jian-er△

(LaboratoryofMedicalMicrobiology,DepartmentofMedicalMicrobiologyandParasitology,SchoolofBasicMedicalSciences,FudanUniversity,Shanghai,200032,China)

Objective To identify the roles of signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) in enterovirus 71 (EV71) infection and replication. Methods According to the observations of the kinetics of STAT3 in rhabdomysarcoma (RD) cells after EV71 infection,and the detection of the effects of loss-and gain-of-function of STAT3 (by knocked-in a short-hairpin RNA or a STAT3 gene into the cellular genome with a lentivirus vector,respectively) on the expression of EV71 VP1,virus plaque-forming,and virus titer after EV71 infection,we evaluated host STAT3 roles in EV71 infection and replication. Results The level of phosphorylated STAT3-Tyr705(pY705-STAT3) was down-regulated significantly after EV71 infection.In the RD cells knocked-down STAT3,p-STAT3 was also down-regulated.The knock-down of STAT3 promoted EV71 infection and replication.By contrast,over-expression of STAT3 showed the opposite effects on EV71 infection.Confocal microscopy analysis and plaque-forming assay indicated that high level of p-STAT3 decreased the cellular susceptibility to EV71 infection. Conclusions Our data indicated that host STAT3 has an important role in EV71 infection and replication,which may be induced by the doen-regulation of phosphorylated p-STAT3 level.Therefore,EV71 infection increased the cellular susceptibility to the virus and promoted the viral replication.

EV71; STAT3; rhabdomysarcoma cell

国家传染病重大专项 (2012ZX10004503-003); 国家自然科学基金基础科学人才培养项目(J1210041); 上海市自然科学基金(09411964500)

R 738.7

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2015.02.004

2014-08-17;编辑:张秀峰)

△Corresponding author E-mail:longjianer@fudan.edu.cn

*This work was supported by the National Science and Technology Major Project on Infectious Diseases (2012ZX10004503-003),Basic Science Youth Training Program of National Science Foundation of China (J1210041),and the Shanghai Science and Technology Fund (09411964500).