Twist和E－cadherin在宫颈鳞癌中的表达及其与KAI1表达的关系

郭苏阳， 李胜泽△， 郭 伟， 承泽农

蚌埠医学院第一附属医院1肿瘤妇科，2肿瘤外科，3病理科，蚌埠 233003

Twist和E－cadherin在宫颈鳞癌中的表达及其与KAI1表达的关系

郭苏阳1， 李胜泽1△， 郭 伟2， 承泽农3

蚌埠医学院第一附属医院1肿瘤妇科，2肿瘤外科，3病理科，蚌埠 233003

目的 探讨宫颈鳞状细胞癌（CSCC）组织中Twist、E－cadherin和KAI1蛋白的表达及其临床意义。方法 通过免疫组织化学ElivisionTMplus方法检测130例CSCC组织、40例宫颈高级别上皮内瘤变（CIN）和40例正常宫颈组织中Twist、E－cadherin和KAI1蛋白的表达。结果 在正常宫颈组织中Twist、E－cadherin和KAI1蛋白的阳性表达率分别为5.0%、95.0%和97.5%；在CIN组中Twist、E－cadherin和KAI1蛋白的阳性表达率分别为42.5%、62.5%和65.0%；在CSCC组织中，Twist、E－cadherin和KAI1蛋白的阳性表达率分别为69.2%、40.8%和43.1%。Twist、E－cadherin和KAI1蛋白的表达水平在不同两组之间，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。Twist蛋白表达水平在CSCC组织中不同分化程度、淋巴结转移与否及浸润深度之间差异均有统计学意义（均P＜0.05）；E－cadherin和KAI1蛋白的表达水平在CSCC组织中的不同分化程度、淋巴结转移与否、浸润深度及FIGO分期之间差异均有统计学意义（均P＜0.05）。Twist蛋白的表达与E－cadherin和KAI1蛋白的表达呈负相关关系（均P＜0.01）；E－cadherin蛋白的表达与KAI1蛋白的表达呈正相关关系（P＜0.01）。生存分析表明Twist蛋白阳性表达组患者的生存时间明显短于阴性组患者；E－cadherin和KAI1蛋白阳性表达组患者的生存时间明显长于阴性组患者。多因素分析发现E－cadherin和KAI1蛋白的阳性表达是影响CSCC患者预后的独立因素。结论 Twist、E－cadherin和KAI1蛋白的异常表达可能参与了CSCC的发生、发展及转移过程；在CSCC组织中检测Twist、E－cadherin和KAI1表达情况可能对CSCC的预后判断有价值。

子宫颈肿瘤； Twist； E－cadherin； KAI1； 预后

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率与死亡率均为女性恶性肿瘤的第2位［1］。其中以鳞状细胞癌最为常见。尽管近年来，针对肿瘤的治疗方法和技术不断更新，但都无法彻底杀灭和根治肿瘤，复发和转移是主要原因。上皮间充质转化（epithelial－mesenchymal transition，EMT）是指上皮细胞在某些特定生理或病理情况下向间充质细胞转化的现象。在EMT发生过程中，上皮细胞表现为其极性和黏附性降低或丧失，细胞骨架重排及细胞外基质重塑，从而改变细胞的外形，使原来呈圆形或立方形的上皮细胞转变为梭形细胞，更易于脱离母体。EMT的发生与恶性肿瘤的浸润、转移关系密切。Twist是一个高度保守的转录因子，是b－HLH蛋白家族的重要成员，可以与E－cadherin（E－cad）基因相互协同作用，诱导肿瘤EMT的发生，在肿瘤的浸润和转移过程中起着重要作用［2］。KAI1又名抗癌一号（Kangai 1），最先于前列腺癌细胞中发现，属于肿瘤转移抑制基因家族，在正常组织中常广泛表达，其表达缺失或降低可能与多种肿瘤的发生及进展关系密切［3］。目前在宫颈鳞状细胞癌（cervical squamous cell carcinoma，CSCC）中关于EMT过程中的Twist、E－cad与KAI1关系的研究尚未见报道，本研究通过免疫组织化学ElivisionTMplus方法检测130例CSCC患者组织中Twist、E－cad和KAI1蛋白的表达情况，分析KAI1与EMT过程的关系，并探讨它们与CSCC肿瘤组织侵袭、转移及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 病例资料

回顾性分析蚌埠医学院第一附属医院临床病理科2008年1月至2009年12月130例存档石蜡包埋CSCC组织标本、40例上皮内瘤变（CIN）组织和40例正常宫颈组织。所有病例均在本院病理科诊断为CSCC，收集临床资料和随访资料完整的病例进行分析，所有患者均随访至死亡或截止至2014年12月，随访时间为12～82个月。临床资料包括年龄、肿瘤大小、肿瘤位置、分化程度、淋巴结转移与否、浸润深度及FIGO分期。

40例正常子宫颈组织取自因子宫肌瘤而切除的全子宫宫颈组织，经病理苏木精－伊红染色证实均为正常宫颈组织。

40例CIN组织均取自宫颈锥切标本，并经病理苏木精－伊红染色证实为高级别CIN组织。

1.2 试剂

鼠抗人KAI1单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司、兔抗人Twist多克隆抗体购自美国Abcam公司、鼠抗人E－cadherin单克隆抗体、ElivisionTMplus配套试剂盒和DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 实验方法

所有标本均经4%中性甲醛溶液固定，组织以石蜡包埋，然后4μm厚连续切片、烤干、接着于二甲苯溶液及等级浓度梯度的乙醇溶液中脱蜡至水洗，采用免疫组织化学ElivisionTMplus法，所有操作步骤均按试剂盒说明书进行。利用已知阳性片作对照，以PBS液代替一抗作为空白对照。

1.4 结果判定

KAI1和E－cadherin均以细胞膜和胞质出现棕黄色颗粒为阳性；Twist以细胞质出现棕黄色颗粒为阳性，有时也会出现胞核着色。采取二次计分法，每例标本随机选择10个高倍视野（×400），计算每个视野中阳性细胞数所占百分比及阳性强度并综合计分。具体方法见相关参考文献［4］。最后将阳性细胞数得分和染色强度得分的乘积作为表达判断结果，若积分≥3分为阳性，＜3分为阴性。免疫组化染色结果由2位病理医师通过独立双盲法读片评定。

1.5 统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件包进行数据分析。Twist、E－cadherin和KAI1表达与正常宫颈组织、各临床及病理因素的相关性采用χ2、Spearman等级相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CSCC组织中Twist的表达及其与临床病理参数的关系

在CSCC组织中，Twist蛋白的阳性表达率为69.2%（90／130），在CIN组中其阳性表达率为42.5%（17／40），而在对照组中的阳性表达率为5.0%（2／40），每两组之间，差异有统计学意义（图1A、1B）。Twist的表达与CSCC患者的年龄、肿瘤大小及FIGO分期均无相关性（均P＞0.05）。随着CSCC组织的分化越差、浸润越深，Twist蛋白的阳性表达率越高，差异有统计学意义。淋巴结转移组中Twist蛋白阳性表达率显著高于淋巴结无转移组，两组之间差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

2.2 CSCC组织中KAI1蛋白的表达及其与临床病理参数的关系

KAI1蛋白在对照组、CIN组和CSCC组中的阳性表达率分别为97.5%、65.0%和43.1%，每两组之间差异均有统计学意义（图1C、1D）。KAI1蛋白的表达与患者的年龄及肿瘤大小等均无相关性（均P＞0.05）。CSCC组织的分化越差、浸润越深，KAI1蛋白的阳性表达率越低，差异有统计学意义（均P＜0.05）；KAI1蛋白的阳性表达率与CSCC患者的FIGO分期及淋巴结转移与否等均有相关性（均P＜0.05）（表1）。

2.3 CSCC组织中E－cadherin蛋白的表达及其与临床病理参数的关系

对照组中E－cadherin蛋白的阳性表达率为95.0%（38／40）；在CIN组中，E－cadherin的阳性表达率为62.5%（25／40）；而在CSCC组中，E－cadherin蛋白的阳性表达率为40.8%（53／130），差异均有统计学意义（图1E、1F）。E－cadherin蛋白的表达与CSCC患者的年龄、肿瘤大小等无关，与肿瘤组织的分化程度、淋巴结转移与否、浸润深度及FIGO分期等均有关，即随着CSCC组织的分化程度越低、浸润越深、FIGO分期越高，E－cadherin蛋白的阳性表达率越低（表1）。

图1 Twist、KAI1和E－cadherin在CSCC和对照组中的表达Fig.1 Expression of Twist，KAI1，and E－cadherin in CSCC group and the control group

表1 CSCC组织中Twist、E－cadherin和KAI1蛋白的表达及其与临床病理参数之间的关系Table 1 Correlation between expression of Twist，E－cadherin，and KAI1 and clinicopathological characteristics in CSCC

2.4 CSCC组织中Twist、E－cadherin和KAI1的表达情况以及它们的关系

在E－cadherin和KAI1蛋白表达阳性组中，Twist蛋白的阳性率分别为52.8%（28／53）和51.8%（29／56）；在Twist蛋白阳性表达组中，E－cadherin和KAI1的阴性率分别为68.9%（62／90）和67.8%（61／90），差异有统计学意义。Spearman相关分析显示，Twist蛋白在CSCC中的阳性表达与E－cadherin（rs＝－0.295，P＜0.01）和KAI1（rs＝－0.329，P＜0.01）的阳性表达呈负相关关系。从表2还可以看出，E－cadherin的表达与KAI1的表达呈正相关关系（rs＝0.480，P＜0.01，见表2）。

2.5 生存分析

Kaplan－Meier生存分析显示，Twist阳性表达组患者的生存时间明显低于其阴性组患者（logrank＝21.545，P＜0.01，图2A）；E－cadherin蛋白阳性表达组患者的生存时间明显高于其阴性组患者（log－rank＝70.974，P＜0.01，图2B）；KAI1蛋白阳性表达组患者的生存时间明显高于其阴性组患者（log－rank＝72.035，P＜0.01，图2C）。

表2 CSCC中Twist、E－cadherin和KAI1各因素之间的相互关系Table 2 Expression of Twist，E－cadherin，and KAI1，and their relationship in CSCC

图2 Twist、E－cadherin和KAI1阳性表达组与阴性表达组CSCC患者生存曲线Fig.2 Survival curves of CSCC patients with positive or negative expression of Twist，E－cadherin and KAI1

2.6 多因素分析

将CSCC患者的年龄（分为＜50岁组和≥50岁组）、肿瘤大小（分为＜4.0 cm组和≥4.0 cm组）、分化程度（分为高分化组、中分化组和低分化组）、淋巴结转移（分为转移组和无转移组）、FIGO分期（分为ⅠA组、ⅡA组和ⅡB组）、Twist表达（分为阳性组和阴性组）、E－cadherin表达（分为阳性组和阴性组）、KAI1表达（分为阴性组和阳性组）等因素引入COX模型进行多因素分析，结果显示E－cadherin和KAI1蛋白的阳性表达是影响CSCC患者生存的独立预后因素（表3）。

表3 130例CSCC患者的多因素分析Table 3 Multivariate survival analysis of 130 patients with CSCC

3 讨论

很多的研究已经发现上皮间充质转化（EMT）在多细胞生物胚胎发育的生理过程中发挥着重要作用。但近年来的研究发现，EMT在恶性肿瘤的发生、浸润、转移及复发等过程中也起着重要作用。在某些微环境中，上皮细胞向间充质细胞转化的时候，失去了上皮细胞的极性及黏附力，获得很强的移动能力，从而易于发生浸润，最终演变成具有间充质细胞形态和特征的细胞［5］。EMT的这些特点使人们对肿瘤细胞侵袭与转移有了新的理论解释［6］。

Twist是一种转录因子，且具有碱性螺旋－环－螺旋（basic helix－loop－helix，b HLH）结构，在胚胎发育和肌形成过程中起重要作用。同时，Twist也具有癌基因的特征，在多种上皮性肿瘤中高表达［79］，与肿瘤的凋亡和血管生成等关系密切，可能会成为肿瘤治疗的新靶点。本研究通过免疫组化方法检测130例CSCC组织中Twist蛋白的表达，发现其阳性表达率达69.2%，显著高于其对照组的阳性表达率，差异有统计学意义；且表达Twist蛋白的肿瘤组织，意味着其分化差、浸润深及易于发生淋巴结转移，且生存时间短，这与文献报道结果一致［10］。即Twist的表达异常增高可能参与CSCC的发生、侵袭及转移过程。

上皮性钙黏蛋白是钙黏蛋白家族成员之一，是一类Ca2＋依赖的糖蛋白，在上皮细胞中起着维持细胞极性及黏附力的作用，维持正常组织和器官的结构和功能。EMT过程中会出现上皮性标记物丧失，最典型就是E－cadherin蛋白的丢失，导致上皮细胞之间的黏附力丧失、极性消失；同时间充质标记物表达增加，如vimentin、Twist及slug等，使细胞的迁移能力增强，导致侵袭和转移。本研究发现E－cadherin蛋白在肿瘤组织中的阳性表达率比对照组中显著降低，差异有统计学意义；并且随着肿瘤分化越差、浸润越深及FIGO分期越高，其阳性表达率也越低，差异有统计学意义；未发生淋巴结转移的肿瘤组织中其阳性表达率显著高于淋巴结发生转移组。生存分析显示E－cadherin蛋白阳性表达组患者的生存时间明显高于其阴性组患者。E－cadherin蛋白表达的降低或缺失，意味着上皮细胞彼此之间的黏附力降低，肿瘤细胞易于脱离母体而造成浸润及转移。

KAI1属于4次跨膜糖蛋白超家族成员之一，最先于前列腺癌中被发现，属于抑癌基因，其主要通过调节肿瘤细胞彼此之间的黏附力而抑制肿瘤细胞的浸润和转移；此外，KAI1还可以抑制转移灶中肿瘤细胞的迁移。其在肿瘤组织主要表现为表达缺失，导致肿瘤细胞之间的黏附力降低而造成浸润和转移。本研究发现，在CSCC中，KAI1的阳性表达率显著低于其对照组中的阳性表达率，并且随着肿瘤组织的分化越低、浸润越深、FIGO分期越高及淋巴结转移组中的KAI1阳性表达率越低。生存分析也显示KAI1蛋白阳性表达组患者的生存时间长，本研究结果与其他学者的结果一致［1112］。本研究结果还显示，在CSCC组织中，Twist蛋白的阳性表达率与E－cadherin和KAI1的阳性表达率呈负相关关系，且E－cadherin与KAI1呈正相关关系。KAI1基因可以通过β－catenin介导的信号转导过程来增加E－cadherin依赖性的上皮细胞之间的黏附力而增强肿瘤细胞间的黏附力［13］，从而阻止癌细胞从原发肿瘤脱离。随着肿瘤的快速进展，KAI1蛋白的表达缺失，导致CSCC肿瘤细胞的上皮极性逐渐消失，黏附力逐渐降低，E－cadherin表达降低或丧失，而此时间充质标记物Twist的表达增强，导致肿瘤细胞由原来圆形或立方形逐渐转变为梭形，运动能力增强，促进了CSCC的EMT过程。经过EMT过程，赋予肿瘤细胞更低的黏附力和更强的运动能力，从而造成肿瘤的浸润及转移。

综上所述，Twist、E－cadherin和KAI1的表达异常可能参与了CSCC的发生、发展及转移过程。因此，早期检测Twist、E－cadherin和KAI1的表达可以作为预测CSCC浸润与转移的指标之一。

［1］ Jemal A，Bray F，Center M M，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61（2）:69－90.

［2］ Ding J，Zhang Z，Pan Y，et al.Expression and significance of twist，E－cadherin，and N－cadherin in gastrointestinal stromals tumors［J］.Dig Dis Sci，2012，57（9）:2318－2324.

［3］ Muneyuki T，Watanabe M，Yamanaka M，et al.KAI1／CD82 expression as a prognostic factor in sporadic colorectal cancer［J］.Anticancer Res，2001，21（2）:3581－3587.

［4］ Wu S，Yu L，Wang D，et al.Aberrant expression of CD133 in non－small cell lung cancer and its relationship to vasculogenic mimicry［J］.BMC Cancer，2012，12:535.

［5］ Kalluri R，Weinberg R A.The basics of epithelial－mesenchymal transition［J］.J Clin Invest，2009，119（6）:1420－1428.

［6］ Thomson S，Petti F，Sujka－Kwok I，et al.A systems view of epithelial－mesenchymal transition signaling states［J］.Clin Exp Metastasis，2011，28（2）:137－155.

［7］ Yu L，Lu S，Tian J，et al.TWIST expression in hypopharyngeal cancer and the mechanism of TWIST－induced promotion of metastasis［J］.Oncol Rep，2012，27（2）:416－422.

［8］ Yu Q，Zhang K，Wang X，et al.Expression of transcription of factors snail，slug，and twist in human bladder carcinoma［J］.J Exp Clin Cancer Res，2010，29:119.

［9］ Ru G Q，Wang H J，Xu W J，et al.Upregulation of Twist in gastric carcinoma associated with tumor invasion and poor prognosis［J］.Pathol Oncol Res，2011，17（2）:341－347.

［10］ 范琼，鲍伟，杨婷婷，等.Twist、E－cadherin、N－cadherin在宫颈鳞癌中的表达及意义［J］.上海交通大学学报:医学版，2012，32（6）:783－787.

［11］ Rotterud R，Fossa S D，Nesland J M.Protein networking in bladder cancer:immunoreactivity for FGFR3，EGFR，ERBB2，KAI1，PTEN，and RAS in normal and malignant urothelium［J］.Histol Histopathol，2007，22（4）:349－363.

［12］ 俞岚，武世伍，周蕾，等.膀胱尿路上皮癌中CD133、CD82／KAI1的表达及其与血管生成拟态的关系［J］.南方医科大学学报，2013，33（9）:1336－1340.

［13］ 刘静，杨桂芳，龚玲玲，等.KAI1／CD82和E钙黏着糖蛋白及整合素β1表达与胃癌侵袭转移的关系［J］.中华病理学杂志，2007，36（8）:558－559.

（2014－11－07 收稿）

Expression of Twist and E－cadherin Protein in Cervical Squamous Cell Carcinoma Tissues and Their Relationship with Expression of KAI1

Guo Suyang1，Li Shengze1△，Guo Wei2et al
1Department of Gynecological Oncology，2Department of Surgical Oncology，the First Hospital Affiliated of Bengbu Medical College，Bengbu 233003，China

Objective To explore the expression of Twist，E－cadherin，and KAI1 protein in the cervical squamous cell carcinoma（CSCC）tissues and the clinical significance.Methods From cervical tissues of 130 CSCC cases，40 cases with high grade of cervical intraepithelial neoplasm（CIN），and 40 normal women，expression of Twist，E－cadherin and KAI1 protein was examined by immunohistochemistry ElivisionTMplus method.Results The positive rate of Twist，E－cadherin，and KAI1 in normal cervical tissues was 5.0%，95.0%and 97.5%，respectively；the positive rate of Twist，E－cadherin and KAI1 in CIN tissues was 42.5%，62.5%，and 65.0%，respectively；the positive rate of Twist，E－cadherin and KAI1 in CSCC tissues were 69.2%，40.8%，and 43.1%.There were significant differences in expression levels of Twist，E－cadherin，and KAI1 among the three groups（all P＜0.05）.The expression of Twist protein was significantly related with grades of tumors，lymph node metastasis，and depth of invasion（P＜0.05）；the expression of E－cadherin and KAI1 protein was negatively correlated with grades of tumors，lymph node metastasis，FIGO stages，and depth of invasion（P＜0.05）.There was a negative association between the expression of Twist and E－cadherin or KAI1（P＜0.01）；and there was a positive association between the expression of E－cadherin and KAI1（P＜0.01）.Kaplan－Meier survival analysis showed that the survival time was shorter in patients with positive expression of Twist than in those with negative expression；the survival time was longer in patients with positive expression of E－cadherin or KAI1 than in those with negative expression.Cox regression analysis showed that positive expression of E－cadherin and KAI1 was independent prognostic factors of CSCC.Conclusion Aberrant expression of Twist，E－cadherin and KAI1 protein may be involved in the initiation，development，and metastasis of CSCC；the combined detection of Twist，E－cadherin，and KAI1 protein may play an important role in predicting the prognosis of CSCC.

cervical neoplasm； Twist； E－cadherin； KAI1； prognosis

R737.33

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.04.008

郭苏阳，女，1980年生，主治医师，医学硕士，E－mail:yuowei810128＠163.com

△通讯作者，Corresponding author，E－mail:Byyfylsz＠163.com