肾炎滴丸的制备与药效学考察

于丽秀，杨玉，何秋月，陈东生

(华中科技大学同济医学院附属协和医院药学部，武汉 430022)

肾炎滴丸的制备与药效学考察

于丽秀，杨玉，何秋月，陈东生

(华中科技大学同济医学院附属协和医院药学部，武汉 430022)

目的 制备肾炎滴丸并考察其药效学。方法 正交实验优化肾炎滴丸的制备工艺；采用切除5/6肾的方法建立大鼠慢性肾衰竭模型，考察肾炎滴丸对慢性肾衰竭大鼠尿蛋白及肾脏组织结构的影响。结果 肾炎滴丸的最佳制备工艺为PEG4000：PEG6000=2：1，药物：基质=1：3，滴制温度80 ℃，滴距7 cm；药效学结果显示：与模型对照组比较，肾炎滴丸组与肾衰丸组大鼠24 h尿蛋白水平均明显降低(P<0.01)，肾炎滴丸组降低更为显著(P<0.05)；病理组织检查结果显示治疗组大鼠肾小管基本恢复正常，间质有少量炎症细胞浸润，肾间质纤维组织增生得到较好抑制。结论 肾炎滴丸制备工艺稳定，且对慢性肾衰竭有较好的作用，但最佳治疗剂量还有待进一步验证。

肾炎滴丸；肾衰竭，慢性；尿蛋白

慢性肾衰竭(chronic renal failure，CRF)又称慢性肾功能不全，是指各种肾脏病导致肾功能渐进性不可逆性减退，直至功能丧失所出现的一系列症状和代谢紊乱所组成的临床综合征。全球由慢性肾脏病所引起的终末期肾衰竭患者数量正以每年8%的速度增长[1]，CRF已经成为影响我国居民健康的严重疾病。寻找治疗CRF的药物显得尤为重要，临床实践证明肾衰丸在治疗急慢性肾炎方面具有一定的优势[2-3]，尤其是在减少蛋白尿方面效果甚好，且对胃肠道刺激小，毒性低，但存在制剂技术落后、繁琐等缺陷。为更好服务于临床，本课题组在肾衰丸处方(大黄、黄芪、僵蚕、水蛭)[3]不变的基础上，改进制备工艺，自制肾炎滴丸，并对工艺进行优化及药效学探讨，为今后的进一步开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物 无特定病原体(specefic pathogen free，SPF) 级健康Wistar大鼠50 只，雄性，体质量(180±20) g，由湖北省疾病预防控制中心实验动物中心提供，并常温饲养于华中科技大学同济医学院动物中心SPF级动物实验室。动物质量合格证号：第00019249号，使用许可证号：SYXK(鄂)2010-0057。

1.2 试药与试剂 黄芪、大黄(安徽广印堂制药有限公司，批号分别为20110226，20110307)，水蛭、僵蚕(安徽亳州市药材总公司中药公司，批号分别为20101216，20110118)，均经华中科技大学同济医学院药学院天然药物教研室鉴定；聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)4000，6000(国药集团化学试剂有限公司，批号分别为T20100531，20100824)；肾衰丸(华中科技大学大学同济医学院附属协和医院药学部制备，批号：20120223)；其他试剂为分析纯。

1.3 仪器 自制滴丸设备；十万分之一分析天平(AUW220D型，日本岛津公司)；旋转蒸发器(RE-52AA型，上海亚荣生化仪器厂)；恒温真空干燥箱(DZF-150 数显型，郑州长城科工贸有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 肾炎滴丸的制备 分别取适量黄芪、大黄粉碎后，按肾衰丸组方比例混合后，置于圆底烧瓶中，加入10倍量70%乙醇浸提2 h，提取两次，滤过，合并滤液，回收乙醇，减压浓缩至相对密度1.26～1.30，恒温真空干燥箱中干燥，得到药粉备用。取处方量过筛的水蛭、僵蚕两味中药，与黄芪大黄药渣一同置于圆底烧瓶中，加入10倍量水煎2次，过滤，合并滤液，减压浓缩至相对密度1.26～1.30，恒温真空干燥箱中干燥，得到药粉备用[4-6]。将基质(PEG4000与PEG6000)按一定比例混合，水浴加热至澄明，然后加入干燥的药粉(药物与基质按照一定的比例)，混合均匀，进行滴制，取出滴丸，除去其表面的冷凝液，即得肾炎滴丸。

1.4.2 正交实验优化肾炎滴丸的制备工艺 由预实验结果发现影响肾炎滴丸成型工艺的几个主要影响因素分别为：PEG4000：PEG6000(A)、药物：基质(B)、滴制温度(C)、滴距(D)。每个因素各取3个水平，正交实验因素水平表见表1。

表1 正交实验因素水平

1.4.3 制备工艺考察 按照《中华人民共和国药典》2010年版一部附录IK滴丸项下的检查项目(质量差异检查法和溶散时限检查法)对制备的滴丸进行考察测定。

1.4.4 肾炎滴丸药效学考察

1.4.4.1 动物模型的建立 用10%水合氯醛麻醉大鼠，距左脊肋骨1.5 cm处斜向外方切口，暴露左侧肾脏，分离肾周围脂肪囊后，用丝线离断结扎上下极肾组织各约1/3，复位肾脏，缝合。1周后切除整个右肾，2次手术共切除5/6肾脏即为模型对照组大鼠。大鼠麻醉后，仅暴露双侧肾脏，剥离肾周脂肪组织后，复位缝合即为假手术组大鼠。

1.4.4.2 实验动物分组及给药 雄性Wistar大鼠40只，适应性喂养1周后，按体质量随机分为4组：假手术组、模型对照组、肾衰丸组、肾炎滴丸组，每组10只。大鼠模型建立后，每天分早晚两次给药，其中假手术组、模型对照组灌服等量温热0.9%氯化钠溶液；肾衰丸组灌服肾衰丸0.9%氯化钠溶液混悬液，相当于给予肾衰丸45 mg·kg-1·d-1；肾炎滴丸组灌服肾炎滴丸0.9%氯化钠溶液混悬液，相当于给予肾炎滴丸0.48 mg·kg-1·d-1。以上各组大鼠均自由饮水和进食，连续灌胃给药8周，末次给药后收集大鼠24 h尿液，并禁食12 h。第2天迅速脱颈处死大鼠，取出残肾，留取肾皮质，置于10%甲醛溶液中固定。

1.4.4.3 观察指标 24 h尿蛋白：末次给药后，收集各组大鼠24 h尿液，测定其尿蛋白含量。肾脏病理组织切片：取10%甲醛溶液中固定的残肾皮质，按常规方法脱水、石蜡包埋、切片作苏木精-伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色以观察肾组织变化情况。

2 结果

2.1 正交实验结果 以圆整度、流动性、硬度、丸重差异为评价指标，由正交实验结果(表2)和方差分析(表3)结果可知：影响肾炎滴丸成形性的主要因素D>A>B>C，其中A对肾炎滴丸的成形性差异有统计学意义(P<0.05)，故而肾炎滴丸的最佳滴制工艺为A2B2C3D3，即PEG4000：PEG6000=2：1、药物：基质=1：3、滴制温度80 ℃、滴距7 cm。

表2 正交实验设计表L9(34)及结果

Tab.2 Design and results of orthogonal test(L9(34))

实验号因素A(PEG4000PEG6000)B(药物基质)C(滴制温度)D(滴距)综合评分/分1111116.32122218.43133318.04212317.85223117.16231216.97313218.48321319.79332117.2K117.26717.53317.66716.900K218.46718.43317.83317.933K317.73317.46717.93318.600R1.1660.9660.2661.700

表3 正交实验的方差分析

按正交实验获得的优化处方制备3批肾炎滴丸。实验结果表明，3批肾炎滴丸的质量差异(RSD<10%)和溶散时限(<30 min)均符合要求，所选工艺条件合理稳定。结果见表4。

表4 正交实验验证结果

Tab.4 Results of verification experiment on orthogonal testn=6

2.2 肾炎滴丸药效学考察结果

2.2.1 24 h尿蛋白的变化 由图1可知，模型对照组24 h尿蛋白水平显著高于假手术组(P<0.01)，与CRF的实验模型相一致；与模型对照组比较，肾衰丸组、肾炎滴丸组两组24 h尿蛋白水平显著降低(P<0.01)，肾炎滴丸组24 h尿蛋白水平较肾衰丸组亦有降低，且两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2.2 组织病理学 见图2，假手术组切面皮质髓界限清晰，间质炎症细胞极少，间质宽度均匀。模型对照组切面见肾皮质增厚，皮髓质分界模糊，肾小管萎缩，间质炎症细胞浸润，间质增宽，呈典型的CRF表现；肾衰丸组切面可见肾皮质稍增厚，皮髓质分界稍模糊，肾小管萎缩，间质炎症细胞浸润，间质略增宽，但较模型对照组清晰，肾功能得到改善；肾炎滴丸组切面可见肾皮质略增厚，皮髓质分界清晰，且较肾衰丸组清晰，肾小管基本恢复正常，间质有少量炎症细胞浸润，肾间质纤维组织增生得到了较好的抑制，肾功能得到改善。

A.假手术组；B.模型对照组；C.肾衰丸组；D.肾炎滴丸组；与模型对照组比较，F=75.39，*1P<0.01，F=68.98，*2P<0.01，F=143.88，*3P<0.01；与肾衰丸组比较，F=9.84，*4P<0.05

图1 4组大鼠24 h尿蛋白结果

A.sham operation group；B.model control group；C.renal failure pill group；D.nephritis dripping pill group；Compared with model control group，F=75.39，*1P<0.01，F=68.98，*2P<0.01，F=143.88，*3P<0.01；compared with renal failure pill group，F=9.84，*4P<0.05

Fig.1 Results of 24 h urine protein in four groups of rats

3 讨论

目前西医尚未找到除透析和肾脏移植之外的比较有效的治疗CRF方法，而中医在预防治疗CRF方面有较大的潜力。中医药采用辨证论治，给予益气健脾、活血化瘀、滋阴补肾、泻毒清浊之药，对患者整体进行微调治疗，适宜该病的预防与治疗。肾炎滴丸在肾衰丸的基础上依据上述原则，由大黄、黄芪、僵蚕、水蛭组成，具有多方面的药理活性，可以针对慢性肾炎的症状与病因进行良好的纠正与施治。大黄具有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、活血祛瘀之功效。黄芪作为我国历来最被推崇的补气药之一，具有中等利尿作用，能显著减少尿蛋白，在肾病的治疗方面应用广泛，研究表明，黄芪通过核酸和蛋白水平抑制转化生长因子-β1的表达，抑制肾小管上皮细胞转分化，同时抑制结缔组织生长因子高表达，从而减轻和改善大鼠肾间质纤维化[7-8]，黄芪也可通过抑制磷酸化MKK3/6和磷酸化p38MAPK蛋白的表达，发挥抑制白细胞介素-1β，诱导肾小球系膜细胞(mesangial cells，MCs)增殖作用，能抑制MCs的细胞外基质积聚，从而减轻肾小球硬化，起到肾保护作用，延缓肾脏病进展。僵蚕主要含蛋白质、脂肪，尚含多种氨基酸以及铁、锌、铜、锰、铬等微量元素，既能息风止痉，又能化痰定惊。水蛭有破血逐瘀通经的功效，可用于DN的治疗[9]。

A.假手术组； B.模型对照组；C.肾衰丸组；D.肾炎滴丸组

肾炎滴丸根据CRF的病因进行相应的组方，可对因和对症治疗。本研究结果显示，与模型对照组和肾衰丸组比较，肾炎滴丸组大鼠24 h尿蛋白水平显著降低(P<0.01或P<0.05)。病理组织检查结果亦表明肾炎滴丸对CRF大鼠有良好的治疗作用。肾炎滴丸可以明显降低CRF大鼠的蛋白尿，提示肾炎滴丸有较好的治疗效果。综上所述，肾炎滴丸在预防与治疗CRF方面有其作用的效应物质基础，其最佳剂量还有待进一步验证。

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DOI 10.3870/yydb.2015.05.013

Preparation of Nephritis Dripping Pills and Its Pharmacodynamic Studies

YU Lixiu, YANG Yu, HE Qiuyue, CHEN Dongsheng

(DepartmentofPharmacy,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China)

Objective To prepare nephritis dripping pills and study its pharmacodynamic effects. Methods The preparation of nephritis dripping pills was optimized by using orthogonal method.The model of chronic renal failure was established through resection of 5/6 kidney, the effect of nephritis dripping pills on rats was investigated by urinary protein and renal pathology analysis. Results The optimal preparation for nephritis dripping pills was as follows：taking PEG4000：PEG6000 =2：1, drug：matrix =1：3,setting temperature at 80 ℃ and dropping distance as 7 cm.The pharmacodynamic results showed that: compared with the model control groups, the nephritis dropping pills and renal failure pills significantly reduced the 24 h urine protein levels (P<0.01)，and the nephritis dripping pills were significant superior to renal failure pills (P<0.05).The histopathological results showed that the renal tubular of treated groups remitted to normal, renal interstitial presented a small amount of inflammation cell infiltration and renal interstitial fibrosis was suppressed. Conclusion The preparation of nephritis dripping pills is relatively stable，and has good therapeutic effects on chronic renal failure，but the optimal dose should be further verified.

Nephritis dripping pill; Renal failure，chronic; Urinary protein

2014-04-09

2014-07-18

于丽秀(1981-)，女，山东青岛人，主管药师，硕士，研究方向：中药药理及制剂。电话：027-85726073，E-mail：ylx120515@163.com。

陈东生(1954-)，男，陕西富平人，教授，硕士生导师，主要从事医院药学、中药药理学研究。电话：027-85726073，E-mail：yjkchen@163.com。

R286；R283

A

1004-0781(2015)05-0617-04