慢性间歇性缺氧对大鼠局灶性脑缺血再灌后神经细胞凋亡的影响

姚力 蔡若蔚 何剑波 李会琪 杨美丽 黄银辉 许盈盈 张恒 陈振杰

慢性间歇性缺氧对大鼠局灶性脑缺血再灌后神经细胞凋亡的影响

姚力 蔡若蔚 何剑波 李会琪 杨美丽 黄银辉 许盈盈 张恒 陈振杰

目的 观察慢性间歇性缺氧(CIH)对大鼠脑缺血再灌注后脑梗死体积、神经元形态结构、细胞凋亡、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(B-cell lymphoma/leukemia-2 gene，Bcl-2)、Bax表达的变化，探讨其对大鼠脑缺血再灌注后可能的神经损害作用机制。方法 采用自制CIH系统对SD大鼠进行干预，然后采用Zea Longa等方法制备局灶性脑缺血再灌动物模型。将42只SD大鼠随机分为假手术组(n=6)、模型组(n=12)、CIH 4周组(n=12)、CIH8周组(n=12)，光镜观察受损脑组织细胞的形态学改变，免疫组织化学染色法检测脑组织Bcl-2和Bax 蛋白表达水平，TUNEL法检测脑细胞凋亡情况，TTC染色检测梗死体积，利用神经功能缺损评分评价神经功能缺损情况。结果 TUNEL染色阳性细胞主要分布在坏死灶的周边和皮质区。CIH8周组大鼠脑梗死体积、神经功能缺损评分、脑细胞凋亡数高于模型组和CIH 4周组(均P<0.05)。与模型组比较，CIH8周组Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05)，Bax蛋白表达增强(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值降低(P<0.05)，CIH4周组Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/Bax比值亦较模型组降低(P<0.05)。而CIH8周组和CIH4周组间Bcl-2、Bax蛋白表达及Bcl-2/Bax比值比较无统计学差异(P>0.05)。结论 (1)CIH可增加脑缺血再灌后大鼠神经功能缺损、梗死体积。(2)随CIH时间延长，大鼠脑缺血后缺血半暗带的细胞凋亡增加，Bax蛋白表达上调，Bcl-2蛋白表达下调。Bcl-2/Bax的变化可能参与了CIH 对脑缺血后细胞凋亡过程的调控。

缺氧缺血，脑；再灌注损伤；bcl-2相关X蛋白质；细胞凋亡

阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(obstructive sleep apnea syndrome，OSAS) 和脑卒中均是临床上的常见病，老年人的高发病。脑缺血再灌注损伤的发生是多种因素及多种机制参与的复杂的病理生理过程。研究证明OSAS是脑卒中的独立危险因素[1-2]。Martinez-Garcia等对166例缺血性脑卒中合并睡眠呼吸暂停的患者进行了5年的随访调查研究结果显示，缺血性脑卒中合并OSAS患者的死亡率明显增加，并且使用持续气道正压通气(continuous positive airway pressure, CPAP)治疗后，能够降低患者死亡风险[3]，提示OSAS可增加缺血性脑卒中患者的病死率。近年研究结果显示，脑缺血再灌注损伤迟发性神经元死亡过程中神经细胞可发生凋亡，细胞凋亡是脑缺血再灌注损伤的重要形式之一[4]。慢性间歇性缺氧(CIH)的氧气浓度变化很大程度上模拟了缺血再氧和的过程。本实验通过观察CIH对大鼠脑缺血再灌注后脑组织B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)、Bax的表达变化，旨在探讨其对大鼠脑缺血/再灌注后可能的神经损害作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 清洁级健康雄性8周龄 SD大鼠 52只，体质量180～200 g，由上海斯莱克实验动物中心提供，许可证号：SCXK(沪)2007-0005。随机取10用于CIH预实验，另42只随机分为假手术组(n=6)、缺血再灌注24 h组(模型组，n=12)、CIH4周组(n=12)、CIH8周组(n=12)。模型组、CIH4周及CIH8周组随机取6只用于脑梗死体积检测，另6只进行Bax、Bcl-2蛋白表达检测。

1.2 CIH系统 间歇性缺气系统S-450氧气检测报警仪购于加拿大BW.Technologies公司，灵敏度0.1%。自制密闭有机玻璃箱，并预留进出气孔，出气孔使用单向活瓣。自制控制系统：由微电脑芯片、继电器、电磁阀、显示器等组成，编写控制软件进行程序控制。使用专用塑料导管连接密闭箱与控制系统。医用压缩氧气浓度>99%，压缩氮气浓度>99% (福州氧气厂提供)。Atman-6500空气泵。

1.3 方法

1.3.1 大鼠CIH预实验：参照谭胜玉等[5]方法将大鼠以苯巴比妥钠按体质量100 mg/kg腹腔注射麻醉，将其腹部朝上固定在缺氧舱内解剖台上，局部消毒后，切开腹部皮肤，分离腹主动脉，其中5只在缺氧舱内氧浓度最低点30 s内直视下抽取腹主动脉血行血气分析，另 5只大鼠在循环充气过程中当缺氧舱内氧浓度恢复至21%时按同样方法抽取。参照文献[6-7]方法自制密闭有机玻璃箱，并预留操作孔由透明薄膜密封进出气孔，其中出气孔使用单向活瓣。箱内气体不断流动,以避免二氧化碳潴留。不同气源有不同的通气管道，均由程序控制的电磁阀开关。通过控制程序及设定各种气体的吹入时间及流量，调控箱内氧浓度，使得每一间断性缺氧循环时间为4 min，其中各种气体吹入时间顺序为：氮气120 s，静息30 s，氧气60 s，空气30 s。各种气体流入状态可通过控制程序经显示器读出。箱内氧浓度由箱内氧气检测报警仪读出，在进行动物实验前，连续 20个循环，每隔20 s记录箱内的氧浓度，取平均值，制作循环中箱内氧浓度变化趋势图。

1.3.2 局灶性脑缺血再灌大鼠模型制备：参照文献[8]制备栓线，参照Zea Longa等[9]方法制备局灶性脑缺血再灌动物模型，脑缺血2 h后再灌注24 h。参考Zea Longa等[9]方法对大鼠进行评分，评分为0分和4分的大鼠均被剔除，符合评分但有蛛网膜下腔出血、手术中动物死亡亦予以剔除，用同一批次的造模成功大鼠补足数量。假手术组栓线插入深度为8～10 mm，其余操作同手术组。

1.3.3 CIH干预处理：CIH8周组和CIH4周组大鼠分别于造模前8周和4周给予CIH干预。每天8:00至16:00时将CIH组大鼠置于间断缺氧系统的密闭箱中经历间歇缺氧，16:00时以后使大鼠生活于大气环境中。假手术组和模型组大鼠在相同条件下饲养，但未给予CIH干预。

1.3.4 免疫组化：脑缺血再灌注24 h后将大鼠断头取脑，以视交叉和其后4 mm处两点行冠状切片，片厚4 mm，经梯度酒精脱水固定、切片、经梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，以备HE染色、TUNEL染色和免疫组织化学染色。将每张切片于镜下随机选取6个不重叠的400倍视野，使用显微照相摄片。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件(美国Media Cybernetics公司)测量累积吸光度值(integrated optical density，IOD) 表示Bcl-2、Bax表达水平。Bcl-2、Bax阳性细胞为胞质黄染。免疫组化检测设阳性对照(从福州迈新公司购买的阳性对照片作阳性对照)和阴性对照(用PBS液代替一抗作空白对照)。

1.3.5 脑梗死体积检测：将鼠脑切除小脑和低位脑干，每隔2 mm连续冠状切片，共5片。采用TTC染色法进行脑梗死体积测定，利用Luxex F图像分析仪测每个脑片的梗死面积，根据公式V=t(A1+A2+…An) -(A1+An)t/2计算梗死体积，其中t为切片厚度，A为梗死面积。

1.4 统计学处理 应用统计软件SPSS17.0进行检验，结果以均数±标准差表示。多组均数间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以α=0.05作为检验水准。

2 结果

2.1 箱内氧浓度测定及大鼠血气分析 每一次循环间歇缺氧舱内最低氧浓度达(8.29±0.31)%，最高氧浓度(23.30±0.47)%(图1)。在缺氧循环中，氧浓度达到8.3%左右时，大鼠动脉血氧饱和度为36.4%～60.5%，血氧分压为23.9～32.6 mmHg，当氧浓度达到21%左右时，大鼠动脉血氧饱和度为93.2%～97.4%，动脉血氧分压为74.7～108.4 mmHg，其血氧饱和度符合人类重度OSAS(SaO2<80%)的诊断标准。

图1 间歇性缺氧箱内氧浓度变化趋势图(1个周期)

2.2 各组大鼠神经功能缺损评分及梗死体积比较 假手术组神经功能缺损评分为0分，且双侧半球均无梗死灶。CIH8周组大鼠神经功能缺损评分及梗死体积与CIH4周组和模型组比较升高(均P<0.05)，而CIH4周组与模型组比较无统计学差异(均P>0.05)。见表1。

表 1 各组大鼠神经功能缺损评分和脑梗死体积比较

注：CIH：慢性间歇性缺氧，图2～3、表2同；与模型组比较，*P<0.05；与CIH4周组比较，△P<0.05

2.3 HE染色结果 假手术组脑组织结构正常，未见缺血缺氧性改变，其余各组梗死区主要位于右侧额、顶部皮质、纹状体、海马区等脑区。模型组梗死灶中心区神经细胞脱失明显，额叶皮质区和纹状体内侧部(相当于缺血半暗带区)出现大片空泡区，炎性细胞浸润明显，高倍镜下梗死区周围神经元固缩、核淡染，间质水中。CIH4周组神经元皱缩、细胞间质疏松、核淡染。CIH8周组可见明显水肿，在额、顶部皮质区神经元固缩，部分神经元脱失，染色浅，细胞间质疏松明显，核不规则，核仁不清。结果见图2。

2.4 细胞凋亡检测 假手术组未见凋亡细胞，其余各组大鼠凋亡细胞主要分布在额叶皮质区及纹状体内侧(相当于缺血半暗带区)，凋亡细胞呈蓝黑色、黑色，胞核固缩深染，呈多边形、锥形、椭圆形、圆形及不规则形，并发出突起,可见凋亡小体(图3)。CIH8周组TUNEL阳性细胞数较模型组和CIH4组升高(均P<0.05)，而CIH4周与模型组比较无统计学差异(P>0.05)。结果见表2。

2.5 免疫组化检测结果

2.5.1 Bax的免疫组化表达：结果见表2、图4。假手术组未见Bax蛋白表达；在额叶皮层及纹状体内侧(相当于缺血半暗带区)，另3组均可见Bax免疫染色阳性细胞，细胞质呈棕黄色、棕褐色。CIH8周组Bax免疫染色阳性细胞表达高于模型组(P<0.05)，余两两比较无统计学差异(均P>0.05)。

A：假手术组(×200)；B：模型组(×400)；C：CIH4周组(×400)；D：CIH8周组(×400)

图2 各组大鼠脑梗死区周围神经元组织形态学改变(HE)

A：假手术组；B、C：分别为模型组和CIH4组，均可见少量凋亡细胞；D：CIH8周组可见大量凋亡细胞

图3 各组大鼠脑神经细胞凋亡细胞数比较(TUNEL染色，×400)

表 2 各组大鼠脑组织免疫组化结果比较±s)

注：IOD：累积吸光度；与模型组比较，*P<0.05；与CIH4组比较，△P<0.05

A：假手术组未见Bax免疫阳性细胞；B、C：分别为模型组和CIH4周组，均可见Bax免疫阳性细胞表达较弱；D：CIH8周组可见Bax免疫阳性细胞表达增强

图4 各组Bax蛋白免疫组化表达比较(MaxVisionTM一步法，×400)

A：假手术组可见Bcl-2免疫阳性细胞微弱表达(箭头所示)；B：模型组可见Bcl-2免疫阳性细胞表达强；C、D：分别为CIH4周组和CIH8周组，均可见Bcl-2免疫阳性细胞表达较弱

图5 各组Bcl-2蛋白免疫组化表达比较(MaxVisionTM一步法，×400)

2.5.2 Bcl-2蛋白表达：假手术组可见微量Bcl-2蛋白表达；在额叶皮层及纹状体内侧(相当于缺血半暗带区)，另3组均可见Bcl-2免疫染色阳性细胞，阳性染色细胞胞质呈棕黄色(图5)。CIH8周组和CIH4周组Bcl-2蛋白表达较模型组降低(均P<0.05)，而CIH8周组与CIH4周组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表2。

2.5.3 各组Bcl-2/Bax蛋白表达比值：CIH8周组和CIH4周组Bcl-2/Bax蛋白比值较模型组降低(均P<0.05)，而CIH8周组与CIH4周组比较无统计学差异(P>0.05)(表2)。

3 讨论

CIH的氧气浓度的变化很大程度上模拟了缺血再氧合的过程[10-12]与缺血再灌注类似的过程[13]。本实验观察了CIH对脑缺血再灌24 h大鼠模型脑组织Bcl-2和Bax蛋白表达及神经细胞凋亡情况，结果显示，CIH8周组Bcl-2蛋白表达减低，Bax蛋白表达增强，同时Bcl-2/Bax比值减低；CIH4周Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/Bax比值较模型组减低，而CIH4周组Bax蛋白表达与模型组比较差异无统计学意义；另外，CIH8周组神经细胞凋亡明显增多，而CIH4周组神经细胞凋亡与模型组比较差异无统计学意义。结果提示CIH可使大鼠脑缺血后缺血半暗带的神经细胞凋亡增加；Bcl-2 和 Bax 这一对凋亡抑制和促进基因参与了CIH对脑缺血后细胞凋亡过程的调控。CIH后细胞凋亡增加和凋亡相关基因Bcl-2 和 Bax的表达异常可能参与了脑缺血再灌神经元的损伤，可能是加重脑缺血后神经元损伤的原因之一。

本实验研究发现，假手术组大鼠神经功能缺损评分均为0分，且无梗死灶，而其余各组大鼠神经功能缺损的评分多为2～3分，2分以上的大鼠脑水肿征象尤为明显，0～1分者，脑水肿不明显。CIH8周组大鼠的神经功能缺损评分及脑梗死体积均比其余各组增高，而CIH4周组与模型组比较无统计学意义，提示随缺氧时间的延长，缺氧程度的加重，CIH可加重脑缺血再灌后大鼠神经功能缺损，并增加大鼠脑梗死的体积。

睡眠是一项重要的生理活动，在人类正常睡眠过程中，不同的睡眠时相对心、肺、脑血管进行着不同的调控。急性呼吸暂停事件发生时常伴发脑血流量急剧下降[14]，夜间睡眠期间呼吸暂停事件反复发作引起的脑缺血作用可因相关的低氧血症以及业已存在的脑血管自动调节功能损害和血管舒张功能受损而加重。目前研究认为夜间睡眠期间频繁发作的呼吸暂停事件扰乱了正常睡眠与心血管系统间的相互生理作用[15]。OSAS对心血管的影响因素涉及神经、体液、血管和炎性反应异常。目前认为，OSAS引起的血流动力学变化以及血管、炎性反应、血栓病机制和氧化应激改变均可能是脑血管疾病的危险因素。CIH加重脑缺血再灌注损伤的可能机制与下列危险因素有关：(1)血流动力学、血凝改变及血管内皮损伤：由于呼吸暂停造成低氧血症，使红细胞增多而致血液黏度增高。研究结果显示OSAS患者存在明显的血小板活化，血小板黏附，血小板的高黏附状态可以造成微循环淤滞[6]。陈晓阳等通过CIH小鼠模型研究发现CIH可以引起心肌缺氧诱导因子1α(HIF-1α)表达增加，并可以促进HIF-1α的目的基因产物血管内皮生长因子(VEGF)、内皮素1(ET-1)的表达，并认为这种病理生理过程可能在OSAS合并心血管系统损害的发病机制中起到了重要作用[7]。血管内皮长期慢性的损害，血小板聚集性增强，血流缓慢、甚至受阻，脑血流量减少，可能造成脑缺血再灌注损伤的增加。(2)交感神经活性增强：OSAS患者交感神经对周围血管的活性明显增高，甚至在白天含氧量正常的清醒状态时也同样如此[8]。目前交感神经活性增加的机制尚不清楚。然而，交感神经系统活性增强和血浆儿茶酚胺水平增高，在长期儿茶酚胺的作用下，血管平滑肌发生重构和肥厚，也可导致血管内皮的损害，这些损害因素也可导致脑缺血再灌注损伤的增加。(3)氧化应激：夜间频繁呼吸暂停引发的间歇性低氧和再灌注，不仅产生大量高度活化的氧自由基，也对血管壁产生缺血再灌注损伤[9,13]。Singh等研究发现氧化应激能够加重OSAS患者的病情，使用抗氧化药物可以改善OSAS患者的睡眠质量[16]。(4)炎性反应的增加：OSAS引发的低氧血症可以启动炎性细胞因子的产生，研究发现睡眠呼吸暂停患者白细胞介素6、肿瘤坏死因子α和C反应蛋白水平增高[17-18]。

综上所述，随着CIH时间延长，脑缺氧程度加重，可使大鼠脑缺血后缺血半暗带的神经细胞凋亡增加，Bax蛋白表达上调，Bcl-2蛋白表达下调，Bcl-2/Bax比值减小。Bcl-2 和 Bax 这一对凋亡抑制和促进基因参与了CIH 对脑缺血后细胞凋亡过程的调控，这可能是CIH增加脑缺血再灌后损伤的部分机制之一。

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(本文编辑：时秋宽)

The effects of chronic intermittent hypoxia on the neuron apoptosis in rats after focal cerebral ischemia-reperfusion injury

YAOLi,CAIRuowei*,HEJianbo,LIHuiqi,YANGMeili,HUANGYinhui,XUYingying,ZHANGHeng,CHENZhenjie.

*DepartmentofNeurology,theSecondAffiliatedHospitalofFujianMedicalUniversity，FuzhouFujian362000，China

CAI Ruowei，Email：rwcai@163.com

Objective To observe the effect of chronic intermittent hypoxia (CIH) on the infarction volume, neuron morphous, neuron apoptosis and the expression of Bcl-2, Bax in rat brain after ischemia reperfusion, and to explore the possible mechanism of nerve damage of CIH in rats after ischemia reperfusion. Methods SD rats were intervened by homemade CIH system and then, focal cerebral ischemia reperfusion animal models were prepared by Zea Longa method, etc. Forty two healthy male rats were randomly divided into sham operation group (n=6), model group (ischemia-reperfusion 24 hours group,n=12), CIH 4 weeks group (cerebral ischemia-reperfusion combining CIH exposure for 4 weeks,n=12), and CIH 8 weeks group (cerebral ischemia-reperfusion combining CIH exposure for 8 weeks,n=12). The morphological changes of the damaged tissue cells were observed by light microscope. The expression of Bcl-2 and Bax were detected by immunohistochemistry. The cell apoptosis and infarction volume were investigated via dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) staining and TTC staining respectively. The national institutes of health stroke scale (NIHSS) were used to evaluate the neurologic deficits. Results TTC staining, TUNEL staining and NIHSS results showed that the infarction volume, neurologic deficits and the number of apoptotic cells in CIH 8 weeks group was much higher than other groups (P<0.05); in CIH 8 weeks group, TUNEL-positive cells were more apparent in the perilesional tissue and cortex. Compared with the model group, the protein expression of Bcl-2 was reduced, while the expression of Bax was enhanced; moreover, the ratio of Bcl-2/Bax was decreased in CIH 8 weeks group (P<0.05). Compared with the model group, the protein expression of Bcl-2 and the ratio of Bcl-2/Bax were significantly reduced in CIH 4 weeks group (P<0.05), but there were no statistical significant differences of the expression of Bcl-2, Bax and the ratio of Bcl-2/Bax between CIH 4 weeks group and CIH 8 weeks group. Conclusions These results indicated that CIH could enhance the infarction volume and neurologic deficits in rats after cerebral ischemia reperfusion and along with CIH, the number of apoptotic cells and the expression of Bax were increased, and the expression of Bcl-2 was decreased, suggesting that the ratio of Bcl-2/Bax may take part in the regulation of cell apoptosis after cerebral ischemia by CIH.

hypoxia-ischemia,brain; reperfusion injury; bcl-2-associated X protein; apoptosis

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.03.007

710077陕西省西安市中国西电集团医院神经内科(姚力、何剑波、李会琪、张恒)；362000福建医科大学附属第二医院神经内科(蔡若蔚、杨美丽、许盈盈)；362400福建省晋江市医院神经内科(黄银辉)；362400福建省安溪县医院神经内科(陈振杰)

蔡若蔚，Email：rwcai@163.com

R743.3

A

1006-2963 (2015)03-0182-06

2014-08-28)