鼻咽癌转移相关分子标志物的研究进展

詹德超　余忠华

[摘要] 鼻咽癌是一种来源于鼻黏膜上皮细胞的恶性肿瘤，是我国南方常见的恶性肿瘤之一。鼻咽癌大多数为低分化癌，恶性程度较高，易发生远处转移。国内外研究表明，肿瘤的侵袭和转移与细胞的异常运动有关，是肿瘤细胞的粘附、降解、运动以及血管生成等多种生物学行为互相作用的动态过程。但是NPC浸润转移的分子机制至今尚未完全阐明。随着现代分子生物学的发展，越来越多鼻咽癌转移的相关分子标志物逐渐被发现。深入了解这些分子标志物的表达及调控，筛选出对鼻咽癌具有较高敏感性、特异性并可进行早期诊断及评估预后的标记物，寻找出药物新靶点进行针对性更强的抗肿瘤治疗具有十分重要的意义。本研究拟对鼻咽癌转移相关分子标志物的研究进展做一综述。

[关键词] 鼻咽癌；转移；分子标志物

[中图分类号] R739.63 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）13-0147-06

[Abstract] Nasopharyngeal carcinoma is a malignant neoplasm which arises from the mucosal epithelium cells of the nasopharynx，it is also one of the common malignant tumors in southern China. Most nasopharyngeal carcinomas are poorly differentiated carcinomas. Nasopharyngeal carcinomas are high degree of malignancy，which prone to distant metastasis.The invasion and metastasis of neoplasm are associated with the perverted movement of cells，which is a dynamic process of biologic behavior interactions among adhesion，degradation and angiogenesis in cancer cells. However， the molecular mechanisms underlying NPC invasion and metastasis have not fully elucidated. With the development of Modem molecular biology，more and more new molecular markers in NPC，such as biomarkers have been gotten to know the related molecules expression and molecular regulation， which play important roles in screening tumor markers with more high sensitivity and specificity，achieving early diagnosis ，predicting treatment prognoses and providing new therapeutic strategies to make it more pertinent in anti-tumor therapy. This study is aimed to review the research progress of molecular marker in metastasis of nasopharyngeal carcinoma.

[Key words] Nasopharyngeal carcinoma；Metastasis；Molecular marker

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）大多数为低分化癌，恶性程度较高，易发生远处转移，是患者治疗失败和死亡的主要原因。鼻咽癌转移是一个多因素、多步骤相互作用的过程，涉及多种基因及其产物的相互作用，目前机制尚未完全阐明。本文就鼻咽癌转移相关分子标志物的研究进展做一综述。

1 EBV

1.1 结构与功能

EB病毒（eostein barr virus，EBV）是1964年Eostein和Barr在研究非洲儿童的恶性淋巴瘤时，从瘤细胞培养中发现的1种嗜人类B淋巴细胞的疱疹病毒，属于γ亚科。EB病毒是一种线状双链DNA病毒，由很多种不同的重复序列构成。在鼻咽癌患者体内，EB病毒主要表达EBER EBV核抗原1基因（EBNA-1）、潜伏膜蛋白基因（LMP-1和LMP-2）[1]。多伦多大学的实验已经证实，EBER EBV核抗原1基因能够促使细胞“永生不死”引起肿瘤细胞不断生长从而导致人体患上某种癌症的分子事件。该研究阐述了EBNA-1通过和细胞中的特殊蛋白结合，继而干扰天然细胞生长调节、导致细胞不断生长、提高癌变几率的分子机制[2]。潜伏膜蛋白基因1在EBV潜伏感染过程中表达，现在不但被确定是唯一具有癌基因编码蛋白特点的EBV基因产物，能够促进细胞癌变和转移，而且是唯一可在体外转化细胞的EBV编码的基因产物，可明显增强EBV介导的B淋巴细胞增殖和永生化[1]。潜伏膜蛋白基因1是一种由386个氨基酸（aa）残基组成的跨膜蛋白，包括3个结构域：①亲水性氨基端胞浆区（l～23 aa）；②疏水性跨膜区（24～186aa）；③亲水性羧基端胞浆区（187～386aa）。有研究表明潜伏膜蛋白基因1主要通过三个不同羧基端功能区发挥作用[3]：一个是位于194～231位氨基酸残基的CTAR1；另一个是位于352～386位氨基酸残基的CTAR2；第三个是275～307位氨基酸残基构成的CTAR3。

1.2 与鼻咽癌转移的关系

EBV编码基因参与免疫逃避和多种信号通路的调节，与鼻咽癌的转移密切相关。潜伏膜蛋白基因1是EBV基因组中发现的第一个能改变细胞形态的癌基因，是诱导侵袭转移的主要因素，通过活化NF-κB、AP-1、JAK/STAT、PI-PLC-PKC等细胞内信号通路，促进细胞转化，从而导致肿瘤细胞具有很强的侵袭和转移能力[4]。Krishna等[5]实验证明，较高浓度EBV感染的鼻咽癌组中VEGF表达较高，提示EBV感染可以使VEGF的表达升高，从而使NPC血管生成增加。Horikawa T等[6]研究表明EBV-LMP1诱导Twist表达增加，促进鼻咽上皮细胞发生上皮-间质转化，同步引起E-Cadherin的下降，导致细胞形态、粘附能力变化，从而使其侵袭和转移能力增加。李刚等[7]研究表明潜伏膜蛋白基因1通过增加贴壁生长、基膜穿透以及细胞移动能力等，进一步促进NPC细胞转移。EBNA1通过与USP7结合和抑制其与p53蛋白的反应来干扰天然细胞调节过程。我们知道其他所有能刺激细胞扩增的病毒均是直接作用于p53导致癌变的，但实验证明EBV是通过影响p53的调节来致癌的[1]。LMP-2有关NPC转移的报道较少。EBV靶向治疗是一种新的针对性更强的治疗方法，通过提高对EBNA1和LMP1、2抗原的细胞免疫以及诱导癌细胞溶解来治疗鼻咽癌。目前一期临床研究已经有大量数据表明EBV靶向治疗对疾病转归是安全有效的[8]。

EBV血清学检测是NPC筛查的常规方法，但EBV抗体检测的特异性差，阳性预测值低，对临床诊治意义不大[9]。但是由于EBV-DNA来源于整合了EBV的鼻咽癌细胞，血浆EBV-DNA定量检测对NPC的临床诊治可谓前景广阔。目前国内外文献认为鼻咽癌患者的分期、预后与EBV水平密切相关，浓度越高，分期越晚，预后越差。血浆中的EBV-DNA浓度可以反映肿瘤的增长和消失，能初步筛选出鼻咽癌残留和复发的患者，是一个敏感性较高的标志物[10]。国内侯雪等[11]分别检测69例初治鼻咽癌患者治疗前、后血浆EBV-DNA水平，研究表明EBV-DNA水平能够预测鼻咽癌有无远处转移。Leung等[12]的研究表明，对于Ⅰ、Ⅱ期的鼻咽癌患者，治疗前血浆EBV-DNA水平>4000 copy/mL，其远处转移几率远高于<4000 copy/mL者，两组数据比较差异具有统计学意义。治疗前鼻咽癌复发患者的血浆中EBV-DNA水平明显高于不复发的病例，治疗后评估为临床完全缓解的患者血浆中EBV-DNA水平非常低下甚至测不到。治疗前血浆中EBV-DNA水平<1500 copy/mL患者的无复发生存率远低于浓度>1500 copy/mL的无复发生存率[1]。假如将NPC和鼻咽部其他肿瘤进行鉴别时，EBV血清学浓度检测可以帮助初步诊断。有研究表明颈部淋巴结出现转移癌，当EBV血清学浓度检测呈阳性时，提示原发肿瘤很可能是鼻咽癌[1]。总之，血浆EBV-DNA定量检测作为一种非侵入性检测方法，对鼻咽癌早期诊断、评估疗效、预测有无复发、远处转移很有意义，并且可行性大，患者容易接受。

在临床工作中，发现部分鼻咽癌未转移前的患者EBV-DNA水平甚至比转移后更高，其原因可能是：①有的微转移灶治疗前已经转移到血液系统中，但是由于现在的检验学、影像学等检查水平的限制，无法检查出来；②经过抗肿瘤治疗后EBV-DNA水平明显下降。另外部分鼻咽癌患者在放化疗综合治疗后，还可检测出较高水平的EBV-DNA，原因可能是有的医师过于担心化疗药物或放疗副作用会影响到患者生活质量，使用的药物剂量比较保守，或放疗处方剂量未达标，导致少量微转移灶没有被完全杀灭掉。

2 VEGF

2.1 结构与功能

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），早期称为血管通透因子（vascular perm eability factor，VPF），能在体内诱导新的血管形成。1989年有研究人员在牛垂体星形胶质细胞体外培养时发现VEGF，通过克隆与基因测序，证实VPF和VEGF是相同基因编码的同一种蛋白。VEGF基因位于6p21.3，全长为14kb。VEGF基因由8个外显子和7个内含子构成，共有A、B、C、D、E 5种亚型。VEGF家族全部成员均可与细胞表面酪氨酸激酶受体结合，构成异二聚体，促使酪氨酸磷酸化，从而激活RAS-RAF-MEK-ERK和PI3信号通路，使转录因子激活或mRNA降解，进一步促进血管生成。VEGF-A具有促使内皮细胞加速有丝分裂、迁移的功能；VEGF-B主要促使胚胎血管的形成；VEGF-C、D可使淋巴管的形成加速[13]。

2.2 与鼻咽癌转移的关系

1990年，美国哈佛大学Folkman博士提出著名的Folkman理论[14]：肿瘤组织的生长，需要依靠新生血管的生成来供应足够的氧气和营养物质来维持。我们知道新生血管是实体瘤生长、侵袭和转移的基础，血管内皮生长因子是迄今为止发现的唯一能够特异地在血管内皮细胞作用的因子，有望广泛应用于临床。VEGF在大部分恶性肿瘤中都呈高表达[15]，但其机制不清。癌症患者微血管密度数量越高，预后越差。研究证实NPC的发生、发展也有血管生成依赖性。VEGF可以使肿瘤血管的形成加速，在恶性肿瘤的生长、浸润、转移过程中具有十分重要的作用。骆梅青等[13]研究表明癌组织中的微淋巴管密度与VEGF-C、VEGFR-3的表达显著相关（P<0.01），证实VEGF-C与VEGFR-3的结合能够加速淋巴管的形成，为恶性肿瘤淋巴转移创造有利条件。Qian等[16]通过测量NPC转移组、未转移组、健康人群的VEGF-C水平，实验证实VEGF-C与NPC转移呈正相关，与局部浸润无关；国内李钦等[17]实验表明，VEGF-C在鼻咽癌组织中阳性表达率为77.5%，并且VEGF-C阳性表达在淋巴结转移组明显高于无淋巴结转移组，在鼻咽正常黏膜组中呈弱表达。由此可见VEGF有望作为初步诊断NPC有无淋巴结转移、评估预后的分子标志物。

宋向芹等[18]实验证实VEGF基因沉默能够影响细胞的侵袭和迁移。蔡鑫章等[19]通过体内实验证实对VEGF进行基因沉默能够抑制实体肿瘤的生长。利用基因沉默技术进行恶性肿瘤靶向治疗已成为当今科研的热点。目前已开发出抑制VEGF抗肿瘤药物[20]，如阿瓦斯汀、恩度等，但药物尚处于试验阶段，加上药物昂贵，临床上患者未能广泛使用。

3 MMP

3.1 结构与功能

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）属于锌蛋白酶超家族成员，1962年Woessner在哺乳动物子宫内发现能够降解胶原的第一个MMP，现已发现26个成员，能够降解细胞外基质（ECM），并与金属蛋白酶抑制剂（TMP）共同调节ECM的动态平衡及基膜的完整性。依据作用底物和片段同源性[21]，基质金属蛋白酶可分为8类，分别为胶原酶（MMP-la、lb、8、13、18）、明胶酶（MMP-2、9）、间质溶解素（MMP-3、10、11）、基质溶解素（MMP-7、26 ）、金属弹性蛋白酶（MMP-12）、膜型金属基质蛋白酶（MMP-14、15、16、17、24、25）、釉质溶解素（MMP20）以及分泌型MMP（MMP-19、21、23A、23B、27、28）。研究证明MMP-2和MMP-9可以降解Ⅳ型胶原，从而促进细胞转移。MMP-2和MMP-9是发现的与肿瘤侵袭和转移最密切相关[22]，研究也最为透切的。MMP-2、MMP-9呈高表达已然成为肿瘤浸润和转移的先决条件[23]。研究表明[24]，MMP-2不但能够降解ECM，而且降解非ECM，能明显抑制肿瘤细胞的凋亡；MMP-9不但能降解蛋白聚糖等多种底物，而且能够降解VEGF，加速血管生长，促进癌细胞的转移。

3.2 与鼻咽癌转移的关系

恶性肿瘤转移时，细胞外基质（ECM）和基底膜是肿瘤生长、扩散的自然屏障。肿瘤细胞对ECM的降解是肿瘤侵袭、转移过程的一个关键节点，通过激活蛋白酶引起细胞外基质酶的降解发挥作用。国内外文献表明基质金属蛋白酶与金属蛋白酶抑制剂生成水平与激活程度的失衡是肿瘤侵袭、转移的关键因素，MMP-2/TMP-2、 MMP-9 /TMP-1的比例失衡与肿瘤侵袭、转移关系最为重要。熊丹宁等[25]利用实验证实MMP-9的活性高低与淋巴结转移潜能呈正相关。罗国庆等[26]研究表明，不但NPC组织中MMP-2和MMP-9的阳性率远高于正常对照组（P<0.05），而且淋巴结转移组阳性率远高于无淋巴结转移组（P<0.05）。研究报道[27]，NPC中MMP-9的阳性表达率为83.87%，癌旁组织中为35.56%，且肿瘤越大、转移范围越广，MMP-9的阳性表达率越高。因此，MMP-2和MMP-9很有可能在NPC发生发展、突破基膜向外扩散及淋巴结转移过程中起到关键作用。MMP-2和MMP-9在转移瘤细胞和肿瘤组织血管的内皮细胞中高表达，可引起癌细胞侵入基质，导致细胞转移，加速肿瘤生长、血管生成。可见MMP-2和MMP-9有望成为鼻咽癌抗肿瘤治疗的新靶点。

值得一提的是[28]，MMP家族在生物体内自己就具有天然的抑制剂家族——MMP组织抑制剂（TIMP）。20世纪70年代发现了第一个天然MMP组织抑制剂（TIMP-1）以后，目前已发现TIMP-2 、-3和-4共四个成员。TIMP-1能够抑制可溶性的基质金属蛋白酶（MMP）。TIMP-2、-3、-4不但能够抑制可溶性的MMP，而且能够抑制膜型MMP。

4 LDH

4.1结构与功能

1954年Hill等率先报道恶性肿瘤患者血清乳酸脱氢酶（LDH）活力增高达96%，引起学者关注。迄今为止在人体血清中共发现5种LDH同工酶[29]，可分为骨骼肌型（M型）和心肌型（H型） 两种亚基。M、H亚基以不同比例构成四聚体同工酶，有以下5种：LDH1=H4、LDH2=H3M1、LDH3=H2M2、LDH4= H1M3、LDH5=M4。LDH主要分布在心、肝、肾、肺及红细胞等器官和组织的细胞质中。肿瘤组织的代谢主要是糖酵解，明显高于正常组织，所以参与糖酵解过程的LDH活性亦明显升高。其机制表现为肿瘤细胞坏死增加，代谢转换率增快，细胞膜通透性增强，继而癌组织参与代谢的酶类释放至血液，导致血清LDH水平增加。有研究表明[30]，癌症患者的血清和肿瘤组织都提示LDH及其同工酶有变化，而且LDH活性和M亚基的增加与细胞恶性过程相平行。研究表明[30]，大多数恶性肿瘤以LDH3升高为主，少数见LDH5升高，伴随LDH1、LDH2下降。所以在临床和科研工作中，监测患者血清LDH及其同工酶水平，可望作为恶性肿瘤的筛选指标、评价疗效、判断预后的方法，目前己用于淋巴瘤、卵巢癌两种恶性肿瘤。但有部分良性疾病，如急慢性肝功能损害、阻塞性黄疽、心肌损害及骨骼肌疾病，其血清LDH及其同工酶也可以升高，这需要临床医生完善患者临床资料，增加检查项目鉴别。

4.2与鼻咽癌转移的关系

众所周知，肿瘤细胞的糖代谢存在瓦博格效应[31]，即癌细胞不同于正常细胞，无论供氧充足与否，均以无氧酵解作为获得能量的方式。作为糖酵解代谢途径中的限速酶，LDH起着非常重要的作用。研究发现恶性肿瘤患者血清中的LDH水平会明显升高。因此可根据患者血LDH水平初步筛选出患者是否有恶性肿瘤。林冯杰等[31]对NPC患者及健康人群进行血清LDH水平检测，发现治疗前鼻咽癌患者血清LDH水平明显高过健康人群。陈建华等[32]报道1例鼻咽癌全身多处转移患者的血清LDH水平最高时是正常值的30余倍。Cheng等[33]报告鼻咽癌患者血清LDH水平偏高者较偏低者易出现远处转移，但不影响局部复发率。但也有研究表明NPC患者不论是初诊组或者复发组，其血清LDH水平与正常对照组比较无显著差异。在临床工作中，发现部分鼻咽癌患者治疗前血清LDH已经升高甚至数倍于正常值，分析其原因：第一，患者治疗前有可能已存在远处转移或亚临床转移病灶；第二，由于血清LDH来源于全身多种组织，不仅取决于肿瘤的大小，有部分良性疾病的血清LDH也可以升高；第三，正常情况下，血清LDH水平也不是一成不变的。另外有的鼻咽癌患者治疗前LDH水平不高，但治疗后患者的LDH水平反而升高，影响因素可能是：①化疗药物对心肌、肝肾细胞等损害；②放射治疗对鼻咽肿物杀伤及放射野其他组织损伤的结果。目前原因不明，尚需进行科学实验和系统临床研究以明确。

5 ALP

5.1结构与功能

血清碱性磷酸酶谱[34]（包括血清碱性磷酸酶ALP、骨型碱性磷酸酶B-ALP）是一组磷酸单酯水解酶，在碱性条件下能够催化磷酸基团的水解和转移。ALP几乎存在于人体所有组织中，在骨骼（成骨细胞）和肝脏含量最高。ALP主要由成骨细胞分泌，在骨折、恶性肿瘤骨转移等损伤骨骼时，分泌碱性磷酸酶增加使磷酸盐沉积，从而修复骨骼，可引起血清ALP活性升高。骨型碱性磷酸酶来源于成骨细胞，如果骨形成大于骨吸收，其血清中浓度会明显升高。

5.2与鼻咽癌转移的关系

崔炳强等[35]研究表明NPC骨转移组、未转移组血清ALP水平远高于正常组（P<0.01）；NPC骨转移组血清ALP水平远高于未转移组（P<0.01）；多发骨转移组远高于单发骨转移组（P<0.05）。提示鼻咽癌患者骨转移程度越重，血清ALP的水平越高。血清ALP是诊断骨骼病变的重要指标，已成为大家共识。研究报道，妇女40岁以后，血清B-ALP水平随年龄增加而升高，特别是绝经后10年，增加达77%，但于60～80岁开始下降至低水平。对20～80岁的女性志愿者进行调查，证实绝经后B-ALP水平较绝经前升高，和年龄呈显著相关性，特别是在骨量减少及骨质疏松患者中，B-ALP水平迅速增高，表明B-ALP能够作为一种敏感标志物来反映骨转换率[36]。Sham等[37]报道ALP>70 U/L[正常参考值为（31.0～115.0）U/L]的N3期鼻咽癌患者远处转移发生率高。

在临床工作中，我们发现鼻咽癌未转移患者的ALP水平升高甚至数倍于正常值，其原因可能是：①鼻咽癌患者已经有微小骨转移灶，但是由于目前检验学、核医学、影像学等条件的限制，无法找到微小骨转移灶；②碱性磷酸酶虽然在骨骼和肝脏含量最高，但亦存在于人体其他组织中，血清ALP水平增高，反映存在其他部位或器官微小骨转移灶（除外骨转移灶）可能。这就需要我们进行大样本的科学实验和临床研究以明确ALP水平与鼻咽癌转移几率是否呈正相关。

6 展望

在临床工作中，我们发现很多早期的鼻咽癌患者治疗后短时间内就已经发生远处转移。因此与鼻咽癌转移相关的分子标志物扮演着越来越重要的角色。一方面治疗前可通过测定患者鼻咽癌组织或血清、血浆中分子标志物，预测治疗后转移危险度的高低，有利于进行个体化治疗，从而降低患者复发率和转移率。另一方面，根据鼻咽癌相关分子标志物，寻找出药物新靶点进行针对性更强的抗肿瘤治疗，可以提高鼻咽癌患者的治愈率。但是目前绝大多数鼻咽癌相关转移标志物，存在敏感性差、特异性更差的普遍问题，进一步寻找具有较高敏感性、特异性的标志物任重而道远。另外很多分子标志物的研究还处于初步探索阶段，还需要进行更系统、更大样本的科学实验和临床研究，以明确其发生、发展和调控机制，进而更好地指导临床诊断和治疗。

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（收稿日期：2015-03-23）