骆驼刺源产乳酸的嗜酸乳杆菌分离鉴定及菌种特性

应璐+蒋慧

摘要：从骆驼刺青贮中分离到1株革兰氏阳性杆菌，经菌落形态特征鉴定、生理生化特征鉴定及16S rDNA序列分析，鉴定为嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）。

关键词：嗜酸乳杆菌;生理生化特性;16S rDNA

中图分类号： Q939.9 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）04-0355-02

收稿日期：2014-06-03

基金项目：国家自然科学基金（编号：30960259、31260562）;大学生创新项目（编号：20131075003）。

作者简介：应 璐（1978—），女，重庆人，硕士，讲师，主要从事微生物教学、科研工作。E-mail：yl_tlm@163.com。

通信作者：蒋 慧，博士，教授，主要从事动物营养及饲料的教学、科研工作。E-mail：jianghui308@126.com。

青贮饲料中微生物系统主要包括乳酸菌、酵母菌、梭菌、霉菌及其他腐败细菌，其中乳酸菌在青贮发酵中起主要作用[1]。骆驼刺（Alhagi sparsifolia Shap）是生长于荒漠、半荒漠地区的多年生豆科木质化草本植物，具有耐干旱、耐盐碱、抗逆性强等优点[2]。豆科牧草蛋白质含量高，可溶性碳水化合物含量低，缓冲能高，附着乳酸菌数目少，不容易成功青贮[3-4]。结果表明，无添加的高水分骆驼刺青贮容易成功，且骆驼刺与苜蓿混贮能显著提高苜蓿青贮品质。近年来，抗生素滥用现象严重，亟须寻找安全高效的替代品[5-7]。地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌是美国食品药品管理局（FDA）、我国农业部批准的饲用微生物[8]。新疆维吾尔自治区特殊的地理位置、地质地貌造就了其干旱、盐碱、极端高温、极端低温等多样的生态环境，形成了具有独特代谢途径、遗传背景的微生物类群[9]。在长期的协同进化过程中，微生物与其宿主形成了相互依赖、相互制约的统一整体[10]。本研究探讨新疆特殊生境微生物与其宿主骆驼刺青贮成功的关系，旨在为合理开发利用骆驼刺资源提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

疏叶骆驼刺采集于塔里木大学校园及其周边，青贮3个月，备用。

1.2 方法

1.2.1 嗜酸乳杆菌的分离纯化 将切碎的样品用灭菌水进行10倍梯度的稀释，充分振荡使其混匀，将混匀后的材料进行倍比稀释，稀释度分别为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，选取10-5、10-6、10-7 3个稀释度，取菌悬液500 μL涂布于MRS培养基固体平板上，每个梯度稀释液涂布3个平板，37 ℃厌氧培养48 h，单菌落革兰氏染色，阳性单菌落分离纯化后MRS液体培养基37 ℃厌氧培养24 h，20%灭菌甘油 -18 ℃ 保存备用。

1.2.2 嗜酸乳杆菌16S rDNA序列分析

1.2.2.1 基因组DNA的提取 取1 mL 活化菌悬液，12 000 r/min 离心1 min，弃上清液，收集菌体。用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA，-20 ℃保存。

1.2.2.2 16S rDNA PCR扩增 将上述制备的细菌基因组DNA 作为PCR 扩增的模板，采用16S rDNA通用引物 27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1 492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′对16S rDNA细菌DNA 进行扩增。PCR反应体系（25 μL）：10×PCR buffer（Mg2+Plus） 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.0 μL，正向、反向引物（2.5 mmol/L）各0.5 μL，rTaq（5 U/μL）酶0.3 μL，模板 1 μL，重蒸水 18.2 μL。PCR 反应程序：95 ℃ 5 min;95 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，30 个循环;72 ℃ 10 min。

1.2.2.3 扩增产物测序、序列分析 使用上海生工生物工程技术服务有限公司的胶回收试剂盒进行16S rDNA扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳检测，按说明书回收、纯化目的片段。纯度检测后，委托上海生工生物工程技术有限公司进行测序，测序结果在NCBI中进行Blast同源比对，鉴定细菌种类。采用DNAstar软件→Alige→One Pair→By Wilbuer-Lipman Method方法比对此菌株与杆菌的模式菌株16S rDNA的同源性。

1.2.3 嗜酸乳杆菌的生理生化特性鉴定 在16S rDNA序列分析基础上进行碳源同化试验、氮源同化试验、产乳酸试验、明胶液化试验、淀粉水解试验、耐盐试验、耐酸试验、温度生长试验[11-12]。

2 结果与分析

2.1 菌落、细胞形态特征

从青贮3个月的疏叶骆驼刺中分离得到1株革兰氏染色阳性细菌，命名为M1。菌体杆状，单个、成对或短链形式，无芽孢，无荚膜，无鞭毛。不规则的乳白色圆形菌落，直径1～2 mm，中央略凸，具光泽，表面光滑。

2.2 16S rDNA序列分析

对菌株M1进行16S rDNA测序，序列1 530 bp，结果见图1。该序列与 GenBank 数据库中已收录序列进行 Blast比对，初步确定其为嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）。采用DNA Star软件分析该序列与嗜酸乳杆菌的模式菌株ATCC 4356 （NCBI登录号：AY773947）16S rDNA基因序列相似性达99.7%。

2.3 生理生化特征

根据16S rDNA序列分析结果对M1菌株进行了生理生化鉴定。由表1可知，M1菌株可以同化碳源α-D-葡萄糖、纤维二糖、D-半乳糖、D-果糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖，不能同化碳源龙胆二糖、L-山梨糖、L-鼠李糖、麦芽三糖、D-松三糖、麦芽糖醇、D-甘露醇、D-甘露糖、D-木糖、丙三醇、山梨醇、木糖醇、松二糖，可以同化氮源（NH4）2SO4 、KNO3。由表2可知，M1菌株的产乳酸试验、明胶液化试验、淀粉水解试验、接触酶试验均呈阳性;15～35 ℃均能生长，45 ℃停止生长;弱酸性到中性条件下均能生长，强酸性条件下停止生长;2%～10% NaCl条件下均能正常生长，12% NaCl停止生长。endprint

表1 菌株M1的碳源、氮源同化试验结果

碳源同化 氮源同化

项目 结果 项目 结果 项目 结果 项目 结果 项目 结果

α-D-葡萄糖 + L-鼠李糖 - 麦芽糖醇 - 丙三醇 - （NH4）2SO4 +

龙胆二糖 - D-果糖 + 乳糖 + 山梨醇 - KNO3 +

纤维二糖 + 蔗糖 + D-甘露醇 - 木糖醇 -

D-半乳糖 + 麦芽三糖 - D-甘露糖 - 麦芽糖 +

L-山梨糖 - D-松三糖 - D-木糖 - 松二糖 -

注：“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应，下表同。

表2 菌株的生理生化试验结果

项目 结果 项目 结果 项目 结果

5 ℃ + pH值为2 - 2%NaCl +

25 ℃ + pH值为3 - 4%NaCl +

35 ℃ + pH值为4 + 6%NaCl +

45 ℃ - pH值为5 + 8% NaCl +

产乳酸试验 + pH值为6 + 10% NaCl +

接触酶试验 + pH值为7 + 12% NaCl -

明胶液化试验 + 淀粉水解试验 +

3 结论

从骆驼刺青贮中分离到1株革兰氏阳性杆菌，经菌落形态特征鉴定、生理生化特征鉴定及16S rDNA序列分析，鉴定为嗜酸乳杆菌。

参考文献：

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[2]曾凡江，张希明，李小明. 骆驼刺植被及其资源保护与开发的意义[J]. 干旱区地理，2002，25（3）：286-288.

[3]张金霞，乔红霞，刘雨田. 水分和添加剂对紫花苜蓿青贮品质的影响[J]. 草业科学，2014，31（4）：766-770.

[4]许庆方. 影响苜蓿青贮品质的主要因素及苜蓿青贮在奶牛日粮中应用效果的研究[D]. 北京：中国农业大学，2005.

[5]程锦泉，刘少础. 超级细菌的警示与滥用抗生素潜在公共卫生问题[J]. 中国公共卫生，2010，26（12）：1521-1522.

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