不同预处理方式对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的神经保护作用

陈立英，王会军，陶小雪，廖仁昊，张 颖，崔妍莉，刘芳芳

预先给予短暂的脑缺血预处理（BIP）可诱导缺血耐受（IT）［1］，激活内源性神经保护机制，减轻缺血再灌注所致的脑损伤，但人为地诱发IT是非常困难和难以想象的，在临床上实施困难。近年来发现预先给予一些药物也可诱导IT，此现象称为药物预处理［2］，研究表明阿司匹林（ASA）可诱导IT，具有直接神经保护作用，其机制可能为ASA的抗炎作用可减轻脑缺血再灌注后的炎症级联反应有关［3］。中药大黄素甲醚（plyscion，Ply）属蓼科植物大黄根茎所含的蒽醌衍生物之一，并具有很强的抗炎作用，已有前期研究证明Ply通过抗炎机制而起到脑保护作用［4］，但对IT的影响报道尚少见。本实验利用大鼠缺血再灌注模型，观察不同预处理方式对大鼠缺血再灌注损伤保护作用的影响，为缺血性脑血管的治疗提供了一种有前途的新方法。

1 材料与方法

1.1 模型制造 将100只健康成年雄性SD大鼠（河北医科大学实验动物中心提供）按随机数值表法分为5组，每组20只。A组：假手术组，B组：脑缺血再灌注组，假手术3d后给予2h大脑中动脉闭塞（MCAO），再灌注22h后处死。C组：脑缺血预处理组，缺血预处理10min，3d后给予2hMCAO，再灌注22h后处死。D组：ASA预处理组，阿司匹林粉剂（河南华利药业有限责任 公 司 提 供，批 号：0780633）以 60mg／kg 剂量溶于2mL生理盐水中，灌胃3次，3d后给予2h MCAO，再灌注22h后处死。E组：Ply预处理组，大黄素甲醚（山东新华制药股份有限公司提供，批号：0506338；以40mg／kg剂量溶于2mL生理盐水中，灌胃3次，3d后给予2hMCAO，再灌注22h后处死。给予A、B、C组等量生理盐水灌胃。

实验动物用10%水合氯醛3ml／kg腹腔注射麻醉后，用Zea－longa等［5］的大脑中动脉线栓法制作大鼠左侧大脑中动脉缺血灌注模型。采用颈部正中切口，结扎并切断左侧颈外动脉，在颈外动脉残端剪一小口，并插入一根顶端粘有石蜡的尼龙丝线，向上深入至分叉以上（19～21）mm，结扎颈外动脉近心端，缺血（以插渔线成功开始计时）后2h实施再灌注，外拉渔线约20 mm恢复MCA供血，完成缺血预处理。假手术组除不插入渔线外，其余操作相同。造模成功标志：大鼠不能伸展右侧前肢（即提尾时右前肢内收屈曲）、行走时向向右转圈（追尾现象）或行走时向右侧倾倒，出现上述三者之一即为造模成功。再灌注3d后用相同方法再次造成MCAO 2h，于处死前进行神经功能缺失评分，心脏取血，后断头处死。

1.2 神经功能缺失评分 按Zea Long5分制［5］标准评分，0分：无功能障碍；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分：向右侧转圈；3分：向右侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。

1.3 脑梗死体积测定 再灌注22h每组随机选取10只动物断头取脑，去除嗅球、小脑和低位脑干，沿冠状面用排刀切成5片，每片厚约2mm，置于2%TTC溶液中，避光染色30min，用10%甲醛缓冲液固定24h后用数码相机照相，正常脑组织呈红色，梗死组织呈白色，利用图像分析法计算各个脑片梗死面积，并计算梗死体积。

1.4 脑组织白细胞介素1β（IL－1β）、肿瘤坏死因子－α（TNF－α）含量测定 再灌注22h后取每组另10只动物用10%的水合氯醛麻醉后处死，取出鼠脑剥离左侧皮质，制成100g／L的脑组织匀浆，低温离心1 5min（3 000r／min）。取上清液采用FFDFr－晶体闪烁计数仪，用放射免疫法测定各组动物脑组织IL－1β和TNF－α的含量。具体操作按大连生物工程公司生产的试剂盒进行。

1.5 统计学处理 计量资料以均数±标准差（x±s）表示，用SPSS13.0统计软件处理，多组比较进行单因素方差分析及两两比较q检验，两组间比较采用t检验。

2 结 果

2.1 神经功能缺失评分 假手术组无神经功能障碍表现。缺血预处理组、ASA预处理组及Ply预处理组神经功能缺失评分与缺血再灌注组比较明显降低（P＜0.01）。Ply预处理组神经功能缺失评分明显降低，与ASA预处理组比较明显降低（P＜0.05）。详见表1。

2.2 血清NSE含量 脑缺血再灌注组血清NSE含量与假手术组比较明显升高 （P＜0.05）。缺血预处理组、ASA预处理组及Ply预处理组与脑缺血再灌注组比较血清NSE含量降低（P＜0.01）。Ply预处理组血清NSE含量与ASA预处理组比较明显降低（P＜0.05）。详见表1。

2.3 脑梗死体积 假手术组无肉眼可见的梗死灶形成。脑缺血再灌注组大鼠均表现不同程度的梗死灶形成。缺血预处理组、ASA预处理组及Ply预处理组与脑缺血再灌注组比较梗死体积缩小（P＜0.01）。Ply预处理组梗死体积与ASA预处理组比较明显缩小（P＜0.05）。详见表1。

表1 各组神经功能缺失、NSE、脑梗死体积比较（x±s）

2.4 脑组织IL－1β和TNF－α含量 脑缺血再灌注组脑组织IL－1β和TNF－α含量与假手术组比较明显升高（P＜0.01）。缺血预处理组、ASA预处理组及Ply预处理组与脑缺血再灌注组比较病变侧脑组织IL－1β和 TNF－α含量降低 （P＜0.05）。Ply预处理组脑组织IL－1β和TNF－α含量与ASA预处理组比较明显降低 （P＜0.05）。详见表2。

表2 各组脑组织IL－1和TNF－α含量（x±s） ng／mL

3 讨 论

BIP是指对脑组织采用机械刺激，如一次或多次短暂性脑缺血再灌注后，使其对以后较长时间的缺血性损伤产生IT［1］。其机制之一为抑制缺血后的炎症反应，诱导脑组织产生内源性保护作用，减轻缺血再灌注所致的神经损伤。本实验发现，提前给予BIP可以使再次缺血时神经功能缺失减轻，梗死体积缩小，血清NSE含量下降，均较缺血再灌注损伤组有统计学意义（P＜0.01）。近年来发现预先给予一些药物也可诱导IT，此现象称为药物预处理［2］，研究表明ASA具有这种作用。提前给予ASA预处理可同样使再次缺血时神经功能缺失减轻，梗死体积缩小，血清NSE含量下降，均较缺血再灌注损伤组有统计学意义（P＜0.01）。

炎症反应可能在缺血再灌注损伤及脑IT中具有重要意义，抗炎治疗可减轻缺血再灌注所致的神经损伤［6］。Ply属蓼科植物大黄的根及根茎所含的蒽醌衍生物之一，可通过血脑屏障，并具有很强的抗炎作用。已有前期研究证明Ply通过抗炎机制而起到脑保护作用［4］，但对IT的影响报道尚少见。本实验发现，提前给予Ply预处理可以使再次缺血时神经功能缺失减轻，梗死体积缩小，血清NSE含量下降，均较ASA预处理组有统计学意义（P＜0.01），中药Ply亦可诱导IT产生脑保护作用，效果优于ASA。

脑缺血后的再灌注损伤是一系列复杂的病理过程，主要与氧化应激反应、能量代谢障碍、炎性反应、兴奋性氨基酸释放、细胞凋亡及突触传递受阻等有关［7］。其中炎性级联反应是一个重要的损伤机制，各种炎症因子的释放在损伤机制中起着重要作用，一方面促进炎性细胞黏附于微血管内皮细胞，机械性堵塞微循环通道，影响组织的血流供应；另一方面促进相关炎性因子释放，导致白细胞在缺血区浸润和聚集，活化的白细胞在缺血区可释放大量毒性氧自由基、蛋白水解酶等物质而进一步损伤局部组织血管，导致血管通透性增加而致组织水肿，加重组织损伤［8］。在炎性级联反应中以炎性细胞因子（如IL－1β、TNF－α）表达上调为首发特征，IL－1β、TNF－α作为炎症反应的起始因子，检测其含量对衡量脑缺血再灌注损伤有重要意义［9］。本实验采用放射免疫分析法动态观察了不同预处理方式对大鼠脑缺血再灌注侧脑组织IL－1β和TNF－α含量的变化。结果发现，缺血再灌注脑组织中IL－1β和TNF－α含量明显升高，且均高于假手术组（P＜0.01）。缺血预处理组、ASA预处理组及Ply预处理组与脑缺血再灌注组比较病变侧脑组织IL－1β和TNF－α含量降低 （P＜0.05）。该结果与相关报道一致［10］。表明IL－1β、TNF－α参与了脑缺血再灌注损伤的发生，在脑缺血性疾病的发生、发展和转归中起一定的作用。而不同方式的预处理可能通过降低IL－1β和TNF－α在病灶侧的过度表达，并对随后发生的脑缺血再灌注损伤起保护性作用。

通过对不同方式预处理的比较，药物预处理具有相对安全、方便、易于控制剂量的优点，且中药Ply具有更加广阔的发展前景。本实验有可能对临床缺血性脑血管病的防治提供新的依据。

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