辽宁阜新地区奶牛隐性乳房炎调查及大肠埃希菌药敏试验

刘耀川，张泽辉，王 庄，董家琪，王怡莹，邓旭明，刘明春＊

（1.沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳110866；2.吉林大学动物医学学院，吉林长春130062；3.辽宁省重大动物疫病应急中心，辽宁沈阳110161）

奶牛乳房炎（Mastitis）又称奶牛乳腺炎，是乳房受到物理、化学及微生物等因素刺激所引起的炎症，对奶业及养殖业危害巨大。其中，隐性乳房炎（Subclinical mastitis）因其隐蔽性高、临床症状不明显、病因繁杂、难以及时治疗等特点而成为研究焦点。据统计，全球每年因奶牛乳房炎造成的经济损失约为350亿美元，其中70%是由隐性乳房炎造成的奶量下降而引起的［1］。奶牛隐性乳房炎不仅能够延长奶牛产后发情期和妊娠时间，而且影响乳产量及品质，甚至造成食品安全问题，威胁人类健康。但由于该病无明显临床症状，给疾病的诊断及防治带来困难。正常牛乳中含有一定数量的体细胞，其中包括淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、乳腺上皮细胞及酸性细胞［2］。当发生乳房炎症时，浸润的白细胞及损伤脱落的上皮细胞会使体细胞数量明显增多，因此乳中体细胞计数（somatic cell count，SCC）是判定乳房健康状况最直接的方法。国外学者多以2×105cells／mL 为临界值判定隐性乳房炎［3］，国内多以5×105cells／mL 为标准［4］。

目前已知能够引起奶牛隐性乳房炎的病原菌已超过150种，包括杆菌、球菌、酵母菌、支原体等，其中以葡萄球菌、大肠埃希菌、链球菌为主。本试验选取辽宁阜新地区具代表性的奶牛养殖场，对190头泌乳期奶牛进行体细胞检测，分离并检测隐性乳房炎大肠埃希菌的药物敏感性，为该地区奶牛隐性乳房炎的防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验样品 2014年8月选取辽宁阜新地区某规模化奶牛养殖场临床表现正常的泌乳期奶牛190头。

1.1.2 主要试剂 营养肉汤（NB）、MH（B）培养基、麦康凯琼脂购于北京奥博星生物技术有限公司；肠杆菌科生化常规鉴定管购于杭州天和微生物试剂有限公司。氧氟沙星（99.0%）、头孢唑啉（99.3%）、头孢噻呋（87.3%）、恩诺沙星（99.9%）、阿奇霉素（92.2%）、氟苯尼考（99.2%）、甲砜霉素（99.7%）、土 霉 素（88.2%）、环 丙 沙 星（100%）、庆 大 霉 素（59.0%）、头孢氨苄（94.2%）、阿莫西林（86.6%）、多西环素（83.6%）、四环素（97.0%）药物标准品、大肠埃希菌ATCC25922购于中国兽医药品监察所。

1.1.3 主要仪器 Somatos Mini KD－400型奶牛体细胞计数仪，PYX－600 隔水电热恒温培养箱，LDZX－50KBS高压灭菌锅，96孔U 型细胞培养板，Themo FIN－1621电动移液器，Eppendorf微量可调加样器等。

1.2 方法

1.2.1 乳样采集 采集样品前用新洁尔灭对4个乳区进行消毒，750 mL／L 酒精对乳头消毒。弃去前3把奶，每个乳区取样50mL，存放于灭菌离心管中，封口、标记，于4℃保温箱保存，并尽快送至实验室。

1.2.2 SCC测定 将采集的乳样置于室温20℃±5℃，经4层纱布过滤，搅拌均匀。取10mL 乳样沿混匀瓶壁加入Somatos Mini KD－400型牛奶体细胞计数仪。再沿混匀瓶壁加入5 mL 检测工作液，按“启动”键开始检测。每个样品重复3次，取算数平均数为该样品的体细胞测定结果。

1.2.3 奶牛隐性乳房炎大肠埃希菌的分离鉴定根据SCC结果，将隐性乳房炎阳性乳样涂于经无菌检验合格的麦康凯培养基中。根据培养基大小，将1mL～2mL乳样用三角玻璃棒均匀涂于麦康凯培养基上。正置待其完全吸收后，于37 ℃倒置培养24h。挑取典型红色金属光泽圆形单菌落于营养肉汤中扩增，置－20 ℃于300 mL／L 甘油中保存待用。按照肠杆菌科生化常规鉴定管说明书要求，对初筛的大肠埃希菌进行葡萄糖、赖氨酸、鸟氨酸、硫化氢、蛋白胨、乳糖、卫矛醇、苯丙氨酸、尿素、枸橼酸钠及氨基酸对照等11项生化反应。根据过夜培养结果对其进行编码，并根据编码手册判定细菌类型。

1.2.4 大肠埃希菌分离株药物敏感性检测

1.2.4.1 菌液制备 将保存的菌种以划线方式接种于麦康凯琼脂平板培养基，37 ℃培养24h，挑取麦康凯琼脂培养基上典型单菌落接种于MH 肉汤中，37 ℃培养至菌液浓度约为1×108CFU／mL。使用时，再用MH 肉汤将其稀释成1×105CFU／mL的应用菌液。

1.2.4.2 抗菌药液的制备 精确称量各药品并按说明溶解，配制成终浓度为1 280μg／mL 的原药液，4℃保存备用。使用时进行二次稀释，工作液的稀释范围大约在0.125μg／mL～128μg／mL。

1.2.4.3 MIC的测定 采用肉汤微量稀释法测定15种抗菌药物对大肠埃希菌分离株的MIC，测定方法及判断标准参照2013年美国临床和实验室标准化研究所的标准。每种药物做2个平行。同时以大肠埃希菌ATCC25922作为质控菌。

2 结果

2.1 奶牛隐性乳房炎检测结果

对190头泌乳期奶牛，760个乳区的乳样进行体细胞检测，以2×105cells／mL 标准进行判定，结果表明，共有65份乳样检测结果为阳性。隐性乳房炎患病率为34.2%，乳区阳性率为8.5%。

2.2 大肠埃希菌分离、鉴定结果

SCC检测为阳性的乳样，经肠杆菌科生化常规鉴定管鉴定，共分离得到26株大肠埃希菌。大肠埃希菌的分离率为40%。

2.3 隐性乳房炎大肠埃希菌药物敏感性试验结果

隐性乳房炎大肠埃希菌分离株对甲砜霉素和头孢氨苄高度耐药，耐药率为100%；对其余药物的耐药率分别为：氟苯尼考73.1%、土霉素65.4%、头孢唑啉57.7%、阿莫西林30.8%、四环素30.8%、恩诺沙星26.9%、阿奇霉素19.2%、氧氟沙星15.4%、多西环素11.5%、环丙沙星11.5%；分离菌株对头孢噻呋和庆大霉素均敏感。14种抗菌药物对26株隐性乳房炎大肠埃希菌的MIC测定结果见表1。

表1 14种抗菌药物对26株奶牛隐性乳房炎大肠埃希菌的MICTable 1 MIC results of 14antibacterial agents against 26 E.coli strains isolated from dairy cows with subclinical mastits

2.4 奶牛隐性乳房炎大肠埃希菌耐药谱分析

本试验所用14种抗菌药物分属于7类，3种为头孢菌素类、3种氟喹诺酮类、1种大环内酯类、2种氯霉素类、3种四环素类、1种氨基糖苷类、1种β－内酰胺类。26株隐性乳房炎大肠埃希菌分离株中2株（7.7%）耐2 类 药，13 株（50%）耐3 类 药，8 株（30.8%）耐4类药，3株（11.5%）耐5类药（表2）。

表2 26株奶牛隐性乳房炎大肠埃希菌耐药谱Table 2 Drug resistance spectrum of 26 E.coli strains isolated from dairy cows with subclinical mastits

3 讨论

奶牛隐性乳房炎无明显临床症状，发病率较高，给养殖业造成巨大经济损失。报道称，陕西地区奶牛隐性乳房炎发病率为43.3%、内蒙古地区为61.84%、贵阳地区约为40%、河北地区为56%、大连地区为65.63%、山东地区为69%［4－13］。本试验对辽宁阜新地区某规模化养殖场190头泌乳期奶牛进行隐性乳房炎检测，结果表明，该地区奶牛隐性乳房炎患病率与国内其他地区相比处于较低水平，乳区阳性率也低于国内其他地区27.3%～69%［9］的阳性率。

对大肠埃希菌分离株进行药物敏感性试验结果显示，26株分离株对14种7类抗菌药物表现出不同程度的耐药性，对甲砜霉素和头孢氨苄的耐药率为100%、氟苯尼考73.1%、土霉素65.4%、头孢唑啉57.7%、阿莫西林30.8%、四环素30.8%、恩诺沙星26.9%、阿奇霉素19.2%、氧氟沙星15.4%、多西环素11.5%、环丙沙星11.5%，对头孢噻呋和庆大霉素敏感。多药耐药以3重为主（50%），其余依次为4重耐药、5重耐药及2重耐药，比率分别为30.8%，11.5%及7.7%。报道显示，河北地区奶牛隐性乳房炎大肠埃希菌对红霉素、四环素、庆大霉素、环丙沙星耐药［9］；内蒙古地区分离株对环丙沙星、庆大霉素耐药［11］。与本试验结果比较可发现，耐药谱与耐药率存在地区性差异，可能与地区间药物使用习惯有关。因此，建议辽宁阜新地区选取庆大霉素、头孢噻呋治疗奶牛隐性乳房炎。

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