浒苔多糖体外抗猪传染性胃肠炎病毒研究

孙秋艳，沈美艳

（山东畜牧兽医职业学院，山东潍坊261061）

猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis，TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）引起的一种以严重腹泻、呕吐和脱水为临床特征的高度接触性传染病［1－3］。猪场一旦暴发此病，可造成新生仔猪100%死亡，损失相当严重。该病目前尚无有效的治疗药物，采用疫苗免疫接种是主要的预防措施，但现有TGEV 疫苗在免疫效果和安全性方面存在着一定的缺陷，所以该病只能对症治疗。应用抗生素易产生耐药性和残留问题，抗生素残留不但导致抗药性的增加，还威胁着人类生命安全，国外将抗生素残留问题作为一种技术贸易壁垒，制约着我国动物性食品的出口。因此，研发天然、低毒、无药物残留的绿色生物制剂成为预防和治疗该病的方向之一。

浒苔（Enteromorpha）俗称苔条、海苔，是绿藻植物石莼科中的水生藻类植物。浒苔作为海域的天然海藻，产量极大，而且大量浒苔生长会对海洋环境造成生态危害，是成本低廉的绿色植物。浒苔多糖［4］是浒苔的关键活性成分，研究表明浒苔多糖具有抑制皮肤 癌［5］、抗肿瘤［6－7］、降血脂［8］、降 血 糖［9］、抗 氧化［10］、抗细 菌［11－12］及 免 疫 调 节 等 功 能［13－14］。浒 苔 多糖与抗生素相比较具有潜在的应用价值。目前对浒苔多糖的抗病毒功能国内外鲜有研究，尤其是浒苔多糖抗TGEV 的研究未见报道。本试验通过浒苔多糖对TGEV 体外抑制作用的研究，为浒苔多糖抗病毒作用和浒苔多糖生物制剂开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 浒苔多糖的提取 新鲜浒苔（藻体暗绿色，管状扁压，中空，主枝明显，分枝较多，密集且细长，符合浒苔特征）8 月份采自青岛海域，清洗干净，晾干后按照水煮醇沉法提取［15］：将浒苔研磨至粉末，用电子天平精确称取粉末加水，100℃煮沸4h，重复3次；合并3次滤液浓缩，加入3倍量950mL／L 乙醇3 000r／min离心20min；取沉淀加入适量超纯水完全溶解，胰蛋白酶消化，Sevage法除蛋白，透析；透析袋内液加入950mL／L乙醇至浓度为600mL／L，静置，离心；沉淀加无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤除脂；得浒苔多糖粗品。用苯酚－硫酸法［16］测得多糖含量为680g／L。高压灭菌，冷冻保存备用。

1.1.2 毒株和细胞 猪传染性胃肠炎病毒－pudue（TGEV－pudue）株、猪睾丸细胞（swine testicle cell，ST）均由复旦大学医学院病原生物系王玉燕老师惠赠。细胞生长液用含100 mL／L 胎牛血清的DMEM，病毒增殖的维持液为含50mL／L胎牛血清的DMEM。

1.1.3 试剂 DMEM（Gibco）、胎牛血清（Gibco）均购自Invirogen公司；胰蛋白酶购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2 方法

1.2.1 TGEV 毒力TCID50的测定 将ST 细胞［17］进行消化传代，将细胞数调整至1×106个／mL，加至96孔细胞培养板中，每孔0.1 mL，37℃、体积分数为5%的CO2温箱中培养，待细胞长成单层后，将TGEV 进行10×系列稀释，选取适当稀释度，每一稀释度接种96孔板中的8孔，每孔0.1 mL，37℃、体积分数为5%的CO2温箱中培养，每隔24h观察CPE情况，至96h。按Reed－Muench［18］公式计算TCID50。

1.2.2 浒苔多糖对ST 细胞安全浓度的测定（CPE法） 称取高压灭菌浒苔多糖粗品1g加入20 mL细胞维持液中溶解，用细胞维持液作2倍连续倍比稀释，加到长成单层ST 的96孔细胞培养板上，0.1 mL／孔，每个稀释度重复8 孔，另设细胞对照，置37℃、体积分数为5%的CO2温箱中培养96h，每隔12h观察CPE 情况，细胞病变率的表示方法：“－”表示无细胞病变；1个“＋”表示10%细胞有病变。根据结果将浒苔多糖用细胞维持液稀释到ST 细胞安全浓度范围，再用细胞维持液对安全浓度浒苔多糖作2倍连续倍比稀释。

1.2.3 浒苔多糖直接杀灭TGEV 作用的测定 选10个递增稀释度倍比稀释的稀释液分别与等体积1 000TCID50病毒液混合，37℃、体积分数为5%的CO2温箱中作用2h和4h，加到长成单层ST 的96孔细胞培养板上，0.1 mL／孔，每个稀释度重复4孔，另设细胞对照和病毒对照。37℃、体积分数为5%的CO2温箱中培养，每隔4h观察CPE，当病毒对照CPE达到100%时，记录各孔CPE情况。

1.2.4 浒苔多糖抑制TGEV 复制作用的测定 先将1 000TCID50病毒液接种至长成单层ST 的96孔细胞培养板上，0.1mL／孔，37℃、体积分数为5%的CO2温箱中吸附2h和4h，弃去病毒液，加入2倍倍比稀释的浒苔多糖稀释液，0.1mL／孔，每个稀释度重复8孔，另设细胞对照和病毒对照。37℃、体积分数为5%的CO2温箱中培养，每隔4h观察CPE，当病毒对照CPE 达到100%时，记录各孔CPE 情况。

1.2.5 浒苔多糖阻断TGEV 吸附作用的测定 选取10个递增稀释度的2倍倍比稀释的浒苔多糖稀释液加到长成单层ST 的96 孔细胞培养板上，0.1 mL／孔，每个稀释度重复4 孔。37℃、体积分数为5%的CO2温箱中作用2h和4h，弃去浒苔多糖稀释液，每孔加入1 000TCID50病毒液0.1mL，37 ℃吸附2h，弃去病毒液，加入维持液，另设细胞对照和病毒对照。37℃、体积分数为5%的CO2温箱中培养，每隔4h观察CPE，当病毒对照CPE达到100%时，记录各孔CPE情况。

2 结果

2.1 TGEV 毒力TCID50的测定

标 准 毒 株TGEV－pudue 株 在ST 细 胞 上 的TCID50为10－6.64／0.1mL。

2.2 浒苔多糖对ST 细胞安全浓度的测定

根据96h观察CPE结果表明，浒苔多糖粗品稀释到1.57mg／mL对ST 细胞的作用与对照组无明显差异，ST 细胞的形态均未有明显改变。因此确定浒苔多糖对ST 细胞无毒性浓度小于1.57mg／mL（图1A 和图1B）。

图1 正常的ST 细胞与感染TGEV 的ST 细胞（100×）Fig.1 Normal and TGEV infected ST cells（100×）

2.3 浒苔多糖对直接杀灭TGEV 作用的测定结果

浒苔多糖对TGEV 具有直接杀灭作用，在ST细胞安全浓度范围内，浒苔多糖对TGEV 直接杀灭作用与浒苔多糖浓度和与TGEV 直接作用的时间有关。浒苔多糖浓度越高、与TGEV 作用时间越长对TGEV 直接杀灭作用就越明显，浒苔多糖与TGEV 作用2h的最小杀灭浓度为0.2mg／mL，作用4h的最小杀灭浓度为0.1mg／mL（图2）。

图2 浒苔多糖直接杀灭TGEV 作用后ST 细胞病变率Fig.2 Cytopathic rate of ST cells after of Enteromorpha polysaccharide action to TGEV

2.4 浒苔多糖抑制TGEV 复制作用的测定结果

浒苔多糖对TGEV 复制的抑制作用效果不甚明显，但仍有一定效果，在ST 细胞安全浓度范围内，浒苔多糖对TGEV 复制的抑制作用与浒苔多糖浓度和病毒感染细胞的时间有关。浒苔多糖浓度越高效果越明显，TGEV 感染细胞时间越长，浒苔多糖对其抑制作用越低。浒苔多糖对TGEV 复制的抑制作用的最小浓度为1.57mg／mL（图3）。

图3 浒苔多糖抑制TGEV 复制作用的ST 细胞病变率Fig.3 Cytopathic rate of ST cells after Enteromorpha polysaccharide inhibiting TGEV replication

2.5 浒苔多糖阻断TGEV 吸附作用的测定

浒苔多糖对TGEV 吸附ST 细胞阻断作用明显。在ST 细胞安全浓度范围内，浒苔多糖的浓度越高，浒苔多糖作用于细胞的时间越长对TGEV 阻断作用越明显。浒苔多糖对TGEV 吸附ST 细胞阻断作用最小浓度与浒苔多糖作用于ST 细胞的时间有关，2h 为0.393 mg／mL，4h 为0.2 mg／mL（图4）。

图4 浒苔多糖阻断TGEV 吸附作用ST 细胞病变率Fig.4 Cytopathic rate of ST cells after Enteromorpha polysaccharide blocking TGEV adsorption

3 讨论

浒苔作为海藻的一种，给人们印象最深的不是它的药用和营养价值，而是对海水的污染，大量浒苔漂浮聚集到岸边，阻塞航道，同时破坏海洋生态系统，严重威胁沿海渔业、旅游业发展。本试验通过水煮醇沉法提取浒苔多糖，并研究浒苔多糖对TGEV体外抑制作用，是变废为宝利国利民的事情。浒苔多糖提取采用的是水煮醇沉法，提取出多糖粗品含有很多的杂质，有可能对ST 细胞具有毒性作用，为了提高浒苔多糖的抗病毒效果还需要优化浒苔多糖提取和试验方法。

本试验结果表明，浒苔多糖对TGEV 具有直接杀灭作用，而且多糖浓度越高作用时间越长，直接杀灭作用越好。浒苔多糖对进入细胞内病毒抑制作用不明显，原因可能是TGEV 进入细胞的速度太快而多糖进入细胞的速度太慢。浒苔多糖对TGEV 吸附细胞具有明显的阻断作用，因此浒苔多糖对TGEV 在体外具有一定的抑制作用。本试验初步证实浒苔多糖有抗病毒的能力，为浒苔多糖在临床上对病毒病的预防和治疗提供了理论依据。

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