披针叶黄华碱对奶牛子宫内膜炎病原菌增殖的影响

李 勇，魏彦明，许 斌

（1.宁夏职业技术学院生命科学技术系，宁夏银川750021；2.甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州730070）

奶牛产后子宫内膜炎为子宫内膜的急性炎症，常发生于分娩后的数天之内，如不及时治疗，炎症易于扩散，引起子宫浆膜或子宫周围炎症，最终导致长期不孕［1］。根据报道，不孕牛中有70%为产后子宫内膜炎所致［2］。当前，有关奶牛产后患子宫内膜炎的确切原因并十分不清楚，但多种非特定的病原微生物是引发本病的常见原因之一。由于不同地区、不同情况下分离得到的细菌种类和比例差异较大，临床上多使用的抗菌药物疗法由于耐药菌株的不断产生，治疗效果不佳，不但使治疗成本增加，还会引起乳制品中药物残留超标，给食品安全带来隐患。

披针叶黄华（Thermopsis lanceolata）属豆科野决明属，主要分布在我国西北地区，该植物具有抗菌、消炎、清热解毒、祛痰、提高免疫力等功效，所含生物碱对各种常见的革兰阴性菌和阳性菌均有一定的抑制作用［3］。目前，国内有关披针叶黄华生物碱对奶牛产后子宫内膜炎抗菌效果的研究未见报道。本研究针对宁夏地区患产后子宫内膜炎的奶牛子宫黏膜中的病原菌进行分离鉴定，依据相关理论，选取披针叶黄华总碱和单体碱，对造成奶牛产后子宫内膜炎的主要致病菌进行体外抑菌试验，为披针叶黄华碱的应用开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料采集 依据奶牛临床型子宫内膜炎的诊断标准［4］，在宁夏银川市周边多个奶牛场选择20个产后子宫内膜炎的典型病例。先清洗患牛阴户，用直肠把握法握住子宫颈，使子宫内黏液流出产道，取子宫分泌物5mL，进行细菌分离培养。

1.1.2 试剂与仪器设备 披针叶黄华总碱（85.2%）、黄 华 碱（92.5%）、四 氢 脱 氧 阿 艮 亭 碱（90.3%）、金雀花碱（96.7%）均为笔者从宁夏盐池地区产披针叶黄华中分离而得；脑心浸液琼脂（BHIA）、血液琼脂平板、麦康凯琼脂培养基、三糖铁培养基均购自青岛海博生物技术有限公司；链球菌鉴定系统gyz－12st、肠杆菌科细菌生化编码鉴定管（GYZ－15e）购自上海江莱生物科技有限公司；30mL／L的H2O2溶液及革兰细菌染液等均为宁夏职业技术学院微生物实验室配制。冰箱，ARll40电子天平，超净工作台，立式压力蒸汽灭菌器，恒温培养箱，数显生化培养箱。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离培养 将病牛子宫中提取的黏液配成1∶10的稀释液，用倍比稀释法制的1∶1 000的稀释液，取此稀释液2份，每份0.1mL，分别接种于普通琼脂平板和血液琼脂平板上，在37℃有氧和厌氧条件下培养24h～48h。根据琼脂平板上的菌落形态进行分类，挑取同一类型数量较多、形态一致的单个菌落进行革兰染色、镜检，将染色特性相似的进行归类。对染色镜检菌体较杂的菌落，进行划线分离纯化。纯化的菌落接种至液体培养基培养，并用甘油保存。

1.2.2 细菌鉴定 对革兰染色呈紫色的阳性球菌做接触酶试验，若试验过程中没有气泡产生则选用链球菌鉴定系统gyz－12st进行鉴定［5］。对革兰染色呈红色的阴性杆菌做氧化酶试验，若试验结果呈阴性即无紫色反应，则按照肠杆菌科细菌生化编码鉴定管（GYZ－15e）说明进行操作［6］。另将革兰染色呈阴性的杆菌接种于麦康凯琼脂培养基上，在37℃恒温箱内培养24h后，观察生长情况，麦康凯琼脂培养基上出现无色至浅橙色，透明或半透明，菌落中心呈暗色的为可疑沙门菌，将可疑沙门菌穿刺接种于三糖铁培养基中，培养18h～24h后观察。若穿刺底部有气体，穿刺后变黑，中间为黄色表面为红色则可初步认定为沙门菌［7］。

1.2.3 生物碱药液与细菌液的配制 用无菌蒸馏水将披针叶黄华总碱、黄华碱、四氢脱氧阿艮亭碱、金雀花碱配制成浓度为500mg／mL的生物碱药液。配制好的受试药物贮存液经无菌处理后贮存于－20℃以下环境［8］。链球菌用100mL／L犊牛血清肉汤培养基接种，37℃培养18h～24h。大肠埃希菌和沙门菌用肉汤培养基接种，培养后在血液琼脂平板上划线培养18h～24h。用接种环挑取单个菌落，接种于2mL～3mL的MH 肉汤中，37℃孵育18h～24h。

1.2.4 细菌的药物敏感试验（纸片法） 采用纸片法测定抑菌圈，进行体外抗菌活性的预试验。取细菌培养物，在营养琼脂平板上密集均匀划线。用无菌镊子夹取各类生物碱药物圆纸片，轻贴在已接种细菌的琼脂培养基表面，一次放好，不能移动。平皿倒置，37℃温箱中培养18h～24h。结果观察。根据纸片周围有无抑菌圈及其直径大小，初步判断细菌对药物的敏感性［9］。

1.2.5 最小抑菌浓度（MIC）的测定 采用试管双倍稀释法进行抗菌药最小抑菌浓度（MIC）测定［9－10］。取A、B、C、D4组试管，每组10支分别编号为1～10号，先将各管依次加入肉汤培养基5mL。再将先前低温贮存浓度为500mg／mL的生物碱药液分别在各组试管中从1～9号管作连续稀释，即吸取5mL药液加入1号管，混合均匀后吸取5mL加入2号管，混合均匀后吸取5mL加入3号管，如此稀释至9号管混合均匀后吸取5mL弃去，第10管为不含生物碱药液的生长对照。此时1～9 号管使之成为500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.96mg／mL的浓度梯度。向A 组试管中依次加入大肠埃希菌，向B组依次加入溶血性链球菌，向C 组依次加入非溶血性链球菌，向D组依次加入沙门菌（每管加0.01mL预先用100倍稀释的新鲜菌液），振荡混匀。放置恒温箱中37℃下培养12h后，以无细菌生长管中的药液最大稀释度为该药的MIC。

1.2.6 结果判定 肉眼观察，与生长对照管比较，无细菌生长的药液最低浓度管，即为该药液对受试菌的MIC。为使得结果更精确，每药重复2次，其平均值即为受试菌的MIC值。

2 结果

2.1 细菌鉴定结果

依据染色镜检、鉴别培养和生化鉴定等指标，病料感染率为100%，从20份病料样本中共分离细菌68株，鉴定出大肠埃希菌（55.8%，38／68）、溶血性链球菌（20.5%，14／68）、非溶血性链球菌（14.7%，10／68）、沙门菌（9.0%，6／68）。病料中菌体形态有的呈卵圆形，长链状排列，有β溶血环，染色后镜检呈革兰阳性球菌；有的呈卵圆形，短链状排列，无β溶血环，染色后镜检呈革兰阳性球菌；有的呈圆形、光滑、湿润、半透明，染色后镜检呈革兰阴性球杆菌；有的则边缘整齐，表面光滑，半透明，有凸起，染色后镜检呈革兰阴性短杆菌；还有的呈圆形、隆起、光滑、湿润，形成β溶血环，染色后镜检呈革兰阴性球杆菌（表1）。

表1 分离出的菌株种类及特性Table 1 The species and characteristics of isolated bacteria

2.2 体外抗菌活性试验

以分离鉴定的大肠埃希菌、溶血链球菌、非溶血链球菌以及沙门菌作为受试菌，以纸片法对不同浓度的四种受试药物进行体外抗菌活性试验（表2）。

2.3 最小抑菌浓度测定结果

采用试管双倍稀释法进行四种受试药物对四种细菌的最小抑菌浓度（MIC）测定，结果见表3。

表2 不同浓度生物碱抑菌圈的测定结果（mm，n＝2）Table 2 The diamer of bacteriostasis zone of different concentrations of alkaloids fromThermopsis lanceolata

表3 不同浓度生物碱体外最小抑菌浓度（MIC）测定结果（mg·mL－1，n＝2）Table 3 The detection results of in vitro minimum bacteriostatic concentration of different concentrations of alkaloids fromThermopsis lanceolata

3 讨论

分娩时或产后期间，微生物可以通过各种感染途径侵入奶牛子宫，约有90%以上的奶牛分娩后子宫中可以分离出感染菌，这些细菌可短期或者长时间存在于子宫内［11－12］。当前引起奶牛产后子宫内膜炎的细菌主要有葡萄球菌、链球菌、大肠埃希菌、棒状杆菌、假单胞菌、变形杆菌、生殖器杆菌、嗜血杆菌、乳酸菌、化脓性放线杆菌和坏死性梭菌和拟杆菌等［13］。由于奶牛子宫内膜炎病原微生物区系比较复杂，不同地区不同情况下细菌种类和比例有差异，因此给治疗和预防本病带来极大的困难［14］。

本试验对宁夏地区产后患子宫内膜炎的奶牛子宫黏液中的病原菌进行分离鉴定，感染率为100%。病料样本中分离细菌68 株，鉴定出大肠埃希菌（55.8%，38／68）、溶血性链球菌（20.5%，14／68）、非溶血性链球菌（14.7%，10／68）、沙门菌（9.0%，6／68）。研究结果显示，本次试验中患奶牛产后子宫内膜炎的病原菌是以感染大肠埃希菌和溶血性链球菌为主，以混合感染为其主要感染方式，这一结果与王桂琴等［15］和李有文等［16］报道略有不同，此种差异可能是由于地区不同或各牛场所采用的治疗情况不一而引起的。健康奶牛的子宫是处于一个相对无菌的环境，其自身的自净能力很强，当在分娩、助产或人工授精等过程中对子宫造成损伤等因素导致机体抵抗力降低时，可引起子宫内的炎症。奶牛子宫内膜炎常在产后2 周内发生，大多为急性感染为主［17］。通常情况下，产后健康奶牛子宫中的细菌数主要集中在产后3d～7d，产后9d后逐渐减少，而细菌感染除大肠埃希菌和葡萄球菌外均不具有连续性，随着子宫复旧的不断完善细菌逐渐减少［18］。

此次研究分离鉴定的主要致病菌大肠埃希菌、溶血性链球菌、非溶血性链球菌和沙门菌可能是与奶牛产后子宫中存在大量血液、脱落的子宫上皮组织等成分有关，因其营养丰富，利于微生物繁殖，加之奶牛产后护理不当，自身抵抗力下降，导致病原微生物大量繁殖，从而引起奶牛发生产后子宫内膜炎。披针叶黄华总碱、黄华碱、四氢脱氧阿艮亭碱对宁夏地区引起奶牛产后子宫内膜炎的四种病原菌即大肠埃希菌、溶血性链球菌、非溶血性链球菌和沙门菌均有一定的体外抑菌活性，其中最为敏感的是非溶血性链球菌，其次为沙门菌、大肠埃希菌以及溶血性链球菌。而金雀花碱则对以上4种细菌无抗菌活性。因此，披针叶黄华总碱、黄华碱、四氢脱氧阿艮亭碱为披针叶黄华碱治疗奶牛产后子宫内膜炎相关制剂的开发提供理论依据。

作为宁夏地区一种常见的天然植物，披针叶黄华中含有的黄华碱、四氢脱氧阿艮亭碱、右旋鹰爪豆碱、金雀花碱等多种生物碱具有清热解毒、抗菌消炎、提高免疫力等功效，对本病的治疗起到积极作用，是一种具有开发前景的中药提取物。

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