制作花粉样片校准双光子荧光显微镜放大倍数及示值误差方法

蒋 聪 张 松 陈 龙 吴小丽

(重庆市计量质量检测研究院，重庆 401123)



制作花粉样片校准双光子荧光显微镜放大倍数及示值误差方法

蒋 聪 张 松 陈 龙 吴小丽

(重庆市计量质量检测研究院，重庆 401123)

主要介绍了制作花粉样片校准双光子荧光显微镜的放大倍数及示值误差的方法。通过对双光子荧光显微镜的构成及其工作原理的分析，在用传统方法不能实现对系统的放大倍数及示值误差进行校准的情况下，研发制作了一套标准花粉样片，用样片作为标准参照物对双光子荧光显微镜的放大倍数及示值误差进行校准，并通过不确定度分析对该方法的可靠性进行了验证。

花粉样片；双光子荧光显微镜；光学放大倍数；示值误差；测量不确定度

0 引言

随着现代生物医学发展，双光子荧光显微镜是为了观察和研究活体细胞的动态生命过程而研发的一种新型显微镜，它结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术。双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是最高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。为形态学、分子细胞生物学、神经科学和药理学等研究领域中重要的研究手段。

由于它的特殊工作原理，其放大倍数和示值误差的校准无法采用普通显微镜的校准方法来实现，对普通显微镜我们通过测微尺进行校准，而现在所有的测微尺都无法在双光子荧光显微镜的实验系统中扫描成像。为此，必须选择一种能够在双光子荧光显微镜下扫描成像的标准器具。目前世界上只有个别发达国家制作有标准荧光球作为校准这种显微镜的标准器，其价值昂贵，且准确度极高，有的只有几纳米，国内量值溯源也有一定困难。我们通过分析比较，尝试了多种方法，最后采用了生物显微镜常用的测试材料花粉颗粒，制作成花粉样片来进行校准。

1 花粉样片的制作与标定

首先采用做分析实验的花粉颗粒在玻璃上制成样片，并对其进行分区，然后在万能工具显微镜上观察，以形状较好的位置容易区分的花粉颗粒作为标准颗粒进行标定，给出标准颗粒的直径值。

为了对显微镜较为全面的量程范围进行校准，需要选择几种直径不同的花粉进行标定，通过万能工具显微镜，很容易发现，不同的花粉颗粒其颜色和尺寸差别是很大的。选取四类不同花粉颗粒，直径从0.01～0.12mm。由于自然花粉不一定都呈现完美的圆形，必须采用单一颗粒在固定方向上标定其直径，以避免校准环节引入花粉形状误差。

花粉样片图见图1。

图1 花粉样片图

2 校准双光子荧光显微镜平台实验系统的放大倍数和示值误差

对已交付运行中的一套北京博锐双光子科技有限公司制造的BR-SUP01型“超高速双光子显微镜实验平台系统”进行了校准测试，方法如下：将制作的花粉样片在万能工具显微镜下标定后，放于双光子荧光显微镜平台实验系统上，依次将标定了直径的一组花粉颗粒用双光子荧光显微镜平台实验系统进行测试，将测试值与万能工具显微镜上的标定值进行比较，得到放大倍数和示值误差。

相对放大倍数误差计算公式：

Δβ=[(Li-L0)/L0]100%

(1)

式中：Δβ为相对放大倍数误差；L0为万能工具显微镜标定的花粉颗粒直径；Li为双光子荧光显微镜平台实验系统测得的花粉颗粒直径。

示值误差计算公式：

ΔL=(Li-L0)

(2)

以下给出一组具体实验数据的分析演算过程：

系统测试状况：测量物镜为40X，扫描与图像采集速度为40fps。测量10个花粉颗粒，其测试数据及计算结果如表1所示。

表1 花粉颗粒测试数据及计算结果 (单位：μm)

以该组数据的最大相对差值计算双光子荧光显微镜平台实验系统的放大倍数相对误差：

Δβ=[(Li-L0)/L0]100%=0.048×100%=4.8%

以该组数据的最大相对差值计算双光子荧光显微镜平台实验系统的示值误差：

（1）组建企业集团财务公司。组建财务公司能够极大地降低企业集团在金融市场中的交易成本，提高利润与企业综合竞争力。具体而言有以下优势：财务公司扩张性强，能够吸引外部有益投资；能够从侧面拓展企业业务，促进企业集团综合竞争力的提高；具有较为直接的融资能力，切实满足企业集团加强内部资金管理以及融资的需求；能够为企业集团与金融机构的结算方式提高创新，打造高效便捷集团内部结算系统。

ΔL=(Li-L0)=1.6μm

校准结论：该双光子显微镜实验平台的放大倍数误差小于5%，示值误差小于2μm，符合JJF 1402—2013《生物显微镜校准规范》要求。

3 不确定度分析

数学模型：

ΔL=(Li-L0)

式中：ΔL为测量点的示值误差，mm；Li为测量点的标称长度，mm；L0为对应测量点的标准线纹尺长度，mm。

式中：c1=1；c2=1

标准不确定度评定：

花粉样片标定误差引入的标准不确定度u(L0)：

可以取标准量引入误差e=2μm，

测量时瞄准误差引入的标准不确定度u(Li)：

瞄准时采用单线瞄准，其瞄准精度a =60″，系统采用10X目镜，物镜放大倍数40X，这时显微镜系统的整体放大倍率为K=400X，引用生物显微镜规范的公式进行计算，其瞄准误差为：

该项瞄准误差主要以均匀分布的方式影响，其标准不确定度为

合成标准不确定度：

扩展不确定度

U=k×uc=2×1.2=2.4μm

k=2

显微镜视场范围为0.2mm，则物镜放大倍数误差的测量不确定度为

4 结论

通过对制作花粉样片校准双光子荧光显微镜平台实验系统的放大倍数方法的不确定度分析，得到该方法的不确定UΔβ=1.2%，满足1/3标准器的选择原则，因此，在没有直接标准器时，可以用间接方法，通过制作花粉样片来校准双光子荧光显微镜平台实验系统的放大倍数。

[1] JJF 1402—2013《生物显微镜校准规范》

[2] JJF 1071—2010《国家计量校准规范编写规则》

[3] JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》

[4] 邬国耀.万能工具显微镜使用功能的拓展.计量技术,2002(8)

10.3969/j.issn.1000-0771.2015.4.17