以草甘膦，马拉·毒死蜱为模型研究有机磷农药与牛血清白蛋白的相互作用*

王 珊，高奕红

(咸阳师范学院 化学与化工学院，陕西 咸阳 712000)

血清白蛋白是血浆中丰富的载体蛋白，可与许多内源、外源性化合物相结合[1]，而结构剖析比较成熟的蛋白质是牛血清白蛋白(bovine serum alhumin，BSA)，是研究蛋白质与小分子的相互作用的对象；研究农药与牛血清白蛋白之间的结合作用，有利于深入了解农药对人、畜的中毒机制，对科学使用农药具有重要意义，也为药物残留检测过程中提取液的选择提供理论依据。

有机磷农药是一类施用的非常广泛的农药，使用后会严重影响植物和水生生物的生长，从而对人类的健康构成威胁[2]。但是关于有机磷-蛋白质相互作用的报道还非常少[3-6]。作者以有机磷药物草甘膦，马拉·毒死蜱为例，研究有机磷与BSA相互作用。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

牛血清白蛋白：分析纯，百灵威试剂公司；草甘膦铵盐(质量分数30%)：分析纯，镇江江南化工有限公司；马拉·毒死蜱(质量分数25%)：分析纯，浙江新安化工集团股份有限公司。

SPECORD 50型紫外可见吸收光谱：德国耶拿公司；RF-5301型荧光分光光度计：日本岛津公司。

1.2 实验步骤

1.2.1 所需溶液的配制

用浓盐酸稀释配置pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液；计算称取牛血清白蛋白固体，配置浓度为2×10-6mol/L的溶液；分别用分析天平称取0.281 7 g草甘膦铵盐药品、0.264 0 g马拉·毒死蜱于小烧杯中，加水溶解，用玻璃棒引流，加入于容量瓶中，并洗涤烧杯和玻璃棒3次都加入容量瓶内，然后加入蒸馏水进行定容，待快到刻度时用滴管逐滴加入直到液面与刻度线相切，并摇匀溶液。

1.2.2 比色管待测溶液的配制

取7支10.0 mL比色管，洗涤干净，进行排号，依次用移液管加入2.0 mL pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液，2.0 mL 0.15 mol/L的氯化钠溶液，2.0 mL的2×10-6mol/L的BSA溶液，用1 mL移液管依次向2～7号加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，然后以蒸馏水定容至10 mL，并摇匀。

1.2.3 测发射荧光

用RF-5301PC荧光分光光度计测发射荧光，固定λ=280 nm，扫描300～540 nm，分别用比色皿测1～7号比色管中溶液，并将所测的结果保存在同一图中，保存数据。

1.2.4 测同步荧光

用RF-5301PC荧光分光光度计测同步荧光，固定λ=280 nm，扫描300～450 nm，分别用比色皿测1～7号比色管中溶液，并将所测的结果保存在同一图中，保存数据。

1.2.5 测紫外吸收

用SPECORD 50型紫外可见分光光度计测紫外吸收，将其波长调整到190～600 nm，进行扫描空气，扫描完空气再依次将1～7号溶液分别倒入比色皿中，并放入紫外可见分光光度计进行检测，并分别保存图及其数据。

2 结果与讨论

2.1 不同浓度的草甘膦铵盐溶液、马拉·毒死蜱溶液与牛血清白蛋白的荧光猝灭作用光谱图

在实验中各个浓度下草甘膦溶液马拉·毒死蜱的加入,都能使BSA荧光强度发生不同程度的猝灭，见图1、图2。

λ/nmc(BSA)=2.0×10-6 mol/L，c(草甘膦铵盐)从1～7分别为0、2×10-4、4×10-4、6×10-4、8×10-4、10×10-4、12×10-4 mol/L图1 不同浓度草甘膦铵盐溶液与牛血清白蛋白的荧光猝灭作用光谱图

λ/nmc(BSA)=2.0×10-6 mol/L，c(马拉·毒死蜱)从1～7分别为0、2×10-5、4×10-5、6×10-5、8×10-5、10×10-5、12×10-5 mol/L图2 不同浓度马拉·毒死蜱溶液与牛血清白蛋白的荧光猝灭作用光谱图

荧光强度的下降说明这些大分子与BSA之间存在着相互作用,并且通过相关稳定性的考察发现这种猝灭作用瞬间就能达到稳定状态,12 h内保持稳定。运用Stern-Volmer(斯特恩一沃尔默)方程：

F0/F=1+kqτ0c=1+KSVc

(1)

其中:F0为猝灭剂不存在时的荧光强度；F为加入猝灭剂后的荧光强度；kq为双分子猝灭过程速率常数；τ0为没有猝灭剂存在下测得的荧光寿命(τ0≈10-8s)；KSV为猝灭常数(Stern-Volmer 猝灭常数)；c代表大分子的浓度。KSV值越大,则说明大分子与BSA间的相互作用越强，见图3、图4。

c(草甘膦铵盐)/10-4c(草甘膦铵盐)从1～7分别为0、2×10-4、4×10-4、6×10-4、8×10-4、10×10-4、12×10-4 mol/L图3 草甘膦铵盐与BSA的Stern-Volmer曲线

c(马拉·毒死蜱)/10-5c(马拉·毒死蜱)从1～7分别为0、2×10-5、4×10-5、6×10-5、8×10-5、10×10-5、12×10-5 mol/L图4 马拉·毒死蜱与BSA的Stern-Volmer曲线

由Stern-Vlomer 曲线拟合得到的方程、KSV和kq见表1。

表1 有机磷与BSA的Stern-Volmer 回归方程及猝灭常数

由表1可知:kq值大于2×1010，猝灭常数KSV得出它们的猝灭常数都大于最大动态猝灭常数2.0×102mol/L，初步推断2种有机磷对BSA的猝灭都为静态猝灭。

对于静态猝灭，荧光强度与猝灭剂的关系表达式推导求出:

(2)

通过双倒数曲线(见图5、图6)和数据计算出草甘膦铵盐的KLB=2.38×102L/mol，马拉·毒死蜱的KLB=1.72×103L/mol。

c(草甘膦铵盐)-1/104c(草甘膦铵盐)从1～7分别为0、2×10-4、4×10-4、6×10-4、8×10-4、10×10-4、12×10-4 mol/L图5 草甘膦铵盐与BSA的双倒数曲线

c(马拉·毒死蜱)-1/105c(草甘膦铵盐)从1～7分别为0、2×10-5、4×10-5、6×10-5、8×10-5、10×10-5、12×10-5 mol/L图6 马拉·毒死蜱与BSA的双倒数曲线

对于静态猝灭，荧光强度与猝灭剂的关系可由荧光分子猝灭剂之间的结合常数表达式推导求出:

lg[(F0-F)/F]=lgK0+nlgc

(3)

其中：K0为荧光猝灭反应的平衡常数，n为结合点位数。以lg[(F0-F)/F]对lgc作双对数图，见图7、图8。

lgcc(草甘膦铵盐)从1～7分别为0、2×10-4、4×10-4、6×10-4、8×10-4、10×10-4、12×10-4 mol/L图7 草甘膦铵盐与BSA的双对数曲线

lgcc(马拉·毒死蜱)从1～7分别为0、2×10-5、4×10-5、6×10-5、8×10-5、10×10-5、12×10-5 mol/L图8 马拉·毒死蜱与BSA的双对数曲线

其线性方程的斜率和截距分别为为结合点位数n和lgK0，见表2。

表2 有机磷与 BSA 结合常数K0、结合点位数n

2.2 不同浓度的草甘膦铵盐溶液、马拉·毒死蜱溶液与牛血清白蛋白的同步荧光光谱图

加入有机磷农药使BSA的内源荧光发生猝灭,同步荧光光谱具有简化光谱、窄化谱带和减少光谱重叠等优点而常被用于探讨蛋白质构象的变化,氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基均有荧光产生，而色氨酸残基是BSA中的主要荧光源.随着有机磷农药浓度的增加，同步荧光光谱不断猝灭，说明它们对BSA的构象有影响，见图9、图10。

λ/nmc(BSA)=2.0×10-6 mol/L，c(马拉·毒死蜱)从1～7分别为0、2×10-5、4×10-5、6×10-5、8×10-5、10×10-5、12×10-5 mol/L图10 不同浓度马拉·毒死蜱溶液与牛血清白蛋白的同步荧光光谱图

由图9、图10可知：有机磷的加入可使BSA分子中色氨酸和酪氨酸残基的荧光发射光谱产生了一定的位移，说明有机磷对BSA的酪氨酸微区和色氨酸微区都有影响，结合位点更接近于色氨酸残基，但同时使色氨酸微区的疏水作用增大，从而疏水性也增大。

2.3 不同浓度的草甘膦铵盐溶液、马拉·毒死蜱溶液与牛血清白蛋白的紫外吸收光谱作用

草甘膦铵盐与马拉·毒死蜱和BSA相互作用的紫外吸收光谱图、纯草甘膦铵盐与纯BSA紫外图、马拉·毒死蜱与纯BSA紫外图见图11～图14。

λ/nmc(草甘膦铵盐)从1～7分别为0、2×10-4、4×10-4、6×10-4、8×10-4、10×10-4、12×10-4 mol/L图11 不同浓度草甘膦铵盐溶液与牛血清白蛋白的紫外吸收光谱图

λ/nmc(马拉·毒死蜱)从1～7分别为0、2×10-5、4×10-5、6×10-5、8×10-5、10×10-5、12×10-5 mol/L图12 不同浓度马拉·毒死蜱溶液与牛血清白蛋白的紫外吸收光谱图

λ/nmc(BSA)=2.0×10-6 mol/L，c(草甘膦铵盐)=2×10-3 mol/L图13 纯草甘膦铵盐与纯BSA紫外图

由图11～图14可知随着有机磷农药用量增加，体系的吸光度呈规律性降低，说明基态的BSA与有机磷农药存在相互作用，形成复合物BSA吸收光谱的变化进一步验证了有机磷农药对BSA的猝灭作用为静态猝灭。

λ/nmc(BSA)=2.0×10-6 mol/L，c(马拉·毒死蜱)=2×10-3 mol/L图14 马拉·毒死蜱与纯BSA紫外图

3 结 论

作者利用了发射荧光，同步荧光光谱，紫外吸收光谱研究了不同浓度下的有机磷溶液与BSA的相互作用。通过计算其kq>2×1010L/mol·s，猝灭常数KSV得出它们的猝灭常数都大于最大动态猝灭常数2.0×102mol/L，所以有机磷草甘膦铵盐和马拉·毒死蜱与BSA的相互作用都属于静态猝灭过程，并求得了二者的结合位点数(n)和结合常数(K0)。实验结果表明，随着有机磷农药浓度的增加，同步荧光光谱不断猝灭，它们对BSA的构象有影响。因有机磷与蛋白质具有较强结合作用。

[ 参 考 文 献 ]

[1] 李海玲,彭书明,李凛,等.4种常用蛋白质浓度测定方法的比较[J].中国生化药物杂志,2008,29(4)：277-278.

[2] 程晓洁,汝少国.有机磷农药遗传毒性研究[J].海洋科学,2008,32(9)：88-92.

[3] 薛泽春，程新胜，杨丽文． 尼古丁猝灭牛血清蛋白荧光机制的研究[J].上海交通大学学报：农业科学版，2006，24(1)：44-47.

[4] 朱晓静,贾风燕,计岳龙,等.磺胺类药物与牛血清白蛋白的相互作用研究[J].烟台大学学报：自然科学与工程版,2010,23(4)：277-282.

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