Efaroxan对胰岛素分泌的调控机制研究

章 毅，刘云峰，高璟英，丁亚琴

(山西医科大学 1.药理学教研室、 2.第一医院内分泌科,山西 太原 030001)

Efaroxan对胰岛素分泌的调控机制研究

章 毅1，刘云峰2，高璟英1，丁亚琴1

(山西医科大学 1.药理学教研室、 2.第一医院内分泌科,山西 太原 030001)

目的 观察Efaroxan的促胰岛素分泌作用特点，并探讨其相关作用机制。方法 应用放免法测定不同条件下Efaroxan对大鼠胰岛素分泌的影响。cAMP放射免疫试剂盒测定胰岛细胞内cAMP含量。结果 Efaroxan促进胰岛素分泌作用具有葡萄糖浓度依赖性，其特点是在高浓度葡萄糖条件下(8.3、11.1 mmol·L-1)增强胰岛素分泌，而在低浓度葡萄糖条件下(0、2.8 mmol·L-1)则没有作用。Efaroxan的拮抗剂KU14R可明显抑制Efaroxan对胰岛素分泌的促进作用，并明显的抑制了forskolin和IBMX对胰岛素分泌的促进作用。胰岛cAMP含量检测发现，forskolin和IBMX明显增加了胰岛细胞cAMP含量，但是Efaroxan和KU14R对胰岛cAMP含量没有影响。结论 Efaroxan促进胰岛素分泌作用与激动cAMP下游信号通路有关，KU14R通过阻断cAMP下游信号转导通路发挥抑制Efaroxan、forskolin和IBMX的促胰岛素分泌作用。

Efaroxan；胰岛素；环磷酸腺苷；KU14R；信号转导；胰岛功能

Efaroxan属于咪唑啉类药物，具有促进胰岛素分泌的作用[1]。电生理和生物化学研究表明，Efaroxan可与胰岛β细胞的ATP敏感性钾(KATP)通道的Kir6.2亚单位结合，进而对胰岛素分泌的调节发挥作用[2-3]。因此认为Efaroxan的促胰岛素分泌机制类似于临床常用的磺脲类抗糖尿病药物。但随后的研究发现，Efaroxan的促胰岛素分泌作用具有葡萄糖浓度依赖特性，与磺脲类药物非葡萄糖浓度依赖的促胰岛素分泌特点有明显的不同[4]。因此Efaroxan对KATP通道的阻断作用可能仅仅是其促胰岛素分泌作用的机制之一，应该还有其他更为重要的调控机制参与了Efaroxan对胰岛功能的调控作用，但目前相关的作用机制并不清楚。本研究观察了Efaroxan的促胰岛素分泌特点，并探讨其相关作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料高糖DMEM培养基，胎牛血清购自美国Gibco公司；Histopaque 1077、Efaroxan、胶原酶P，多聚赖氨酸及青链霉素购自美国Sigma公司。KU14R购自英国Tocris公司。大鼠胰岛由180～250 g Wistar大鼠分离所得。大鼠胰岛素放射免疫试剂盒购自北京北方生物技术公司。

1.2 主要仪器细胞培养箱(北京博奥恒信)；超净工作台(北京世安科林净化技术有限公司)；倒置显微镜(OLYMPUS，日本)；电子天平(上海精密仪器)；台式离心机(长沙湘仪仪器)；体式显微镜(上海中恒仪器)。

1.3 方法

1.3.1 胰岛分离及培养 分离大鼠胆总管，将胶原酶P经胆总管注入胰腺内，摘除含酶液的胰腺，将其置于离心管中37℃水浴消化，收集消化后的胰腺组织，Histopaque 1077梯度离心，显微镜下挑取胰岛。置于DMEM培养液中培养胰岛。详细步骤参见我们之前报道的方法[5]。

1.3.2 胰岛素分泌实验 根据实验要求配制含不同浓度葡萄糖的KRBH孵育液。胰岛置于含KRBH的孵育管中，加入待测药物，培养箱中孵育60 min，收集上清，放射免疫法测定胰岛素含量。详细步骤参见我们之前报道的方法[5]。

1.3.3 环磷酸腺苷(cAMP)测定 根据实验要求配制含不同浓度葡萄糖的KRBH孵育液。胰岛置于含KRBH的孵育管中，加入待测药物，培养箱中孵育60 min，超声波粉碎胰岛，放射免疫法测定cAMP含量。详细步骤参见我们之前报道的方法[5]。

2 结果

2.1 Efaroxan对胰岛素分泌的影响在不同葡萄糖浓度(0、2.8、8.3、11.1 mmol·L-1)条件下，我们发现100 μmol·L-1的Efaroxan对胰岛素分泌的促进作用有明显的葡萄糖浓度依赖特性。与其平行对照组(control)相比，在较低葡萄糖浓度(0、2.8 mmol·L-1)时，Efaroxan对胰岛素分泌并无明显影响；而在较高葡萄糖浓度(8.3、11.1 mmol·L-1)时，Efaroxan则明显的促进了胰岛素的分泌(P<0.01)，见Tab 1。

Tab 1 Effects of Efaroxan on insulin secretion atdifferent glucose ±s,n=6)

**P<0.01vscontrol

2.2 Efaroxan拮抗剂(KU14R)对Efaroxan和forskolin引起的促胰岛素分泌作用的影响本组实验均在8.3 mmol·L-1葡萄糖浓度条件下完成。同对照组相比，100 μmol·L-1的Efaroxan明显的促进了胰岛素分泌(P<0.01);给予Efaroxan拮抗剂KU14R(100 μmol·L-1)，则明显的抑制了Efaroxan的作用。应用腺苷酸环化酶激动剂forskolin(5 μmol·L-1)也明显的促进了胰岛素分泌，同对照组比差异有显著性(P<0.01)。值得注意的是，forskolin的这一作用也可以被KU14R明显的抑制。Forskolin通过激动腺苷酸环化酶可使细胞内环磷酸腺苷(cAMP)含量增加(见tab 4)，因此本实验提示Efaroxan促胰岛素分泌作用可能与cAMP有关，见Tab 2。

GroupInsulinrelease/ng·islet-1Control0.83±0.06Efaroxan1.52±0.15##Efaroxan+KU14R0.90±0.07**Forskolin1.75±0.13##Forskolin+KU14R0.96±0.17△△

##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsEfaroxan;△△P<0.01vsforskolin

2.3 Efaroxan拮抗剂(KU14R)对IBMX引起的促胰岛素分泌作用的影响在8.3 mmol·L-1葡萄糖浓度条件下，观察KU14R自身对胰岛素分泌的影响，结果表明KU14R对胰岛素分泌并没有明显的作用(P>0.05vscontrol)。给予磷酸二酯酶抑制剂IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤,50 μmol·L-1)则明显促进了胰岛素分泌(P<0.01vscontrol)。当给予KU14R后，IBMX的促胰岛素分泌作用则被明显抑制(P<0.01)。IBMX通过抑制磷酸二酯酶减少cAMP的降解，从而使胰岛β细胞内cAMP含量增高而发挥作用(见tab 4)，因此本实验结果也表明KU14R通过抑制cAMP信号通路发挥抑制胰岛素分泌的作用，见Tab 3。

GroupInsulinrelease/ng·islet-1Control0.63±0.05KU14R0.71±0.06IBMX1.25±0.06**IBMX+KU14R0.72±0.04##

**P<0.01vscontrol；##P<0.01vsIBMX

2.4 不同药物处理对胰岛cAMP含量的影响应用cAMP放射免疫测定试剂盒，我们检测了在8.3 mmol·L-1葡萄糖条件下所用药物对胰岛cAMP含量的影响。结果表明，在未给予KU14R时，Efaroxan对cAMP含量无明显影响，但forskolin和IBMX均使cAMP含量明显升高(P<0.01vscontrol)。当给予KU14R后，与其平行对照组相比，KU14R并没有对cAMP含量产生明显的影响。详见Tab 4。

groupcAMP/fmol·islet-1-KU14R+KU14RControl3.81±0.803.9±0.50Efaroxan3.57±0.433.77±0.56Forskolin45.52±2.45**39.76±3.05IBMX23.83±3.06**21.79±3.63

**P<0.01vscontrol

3 讨论

在本研究中，我们观察到Efaroxan具有葡萄糖依赖性的促进胰岛素分泌作用，其特点是在高浓度葡萄糖条件下增强胰岛素分泌，而在低浓度葡萄糖条件下则没有作用，与此前的文献报道结果一致[2]。应用Efaroxan的拮抗剂KU14R[6, 7]，我们对Efaroxan的作用机制进行了研究。结果表明，KU14R可明显抑制Efaroxan对胰岛素分泌的促进作用。同时我们发现，KU14R明显的抑制了forskolin对胰岛素分泌的促进作用。大量研究表明[5]，forskolin可通过激动腺苷酸环化酶，升高胰岛β细胞cAMP而发挥促进胰岛素分泌的作用。因此我们的结果提示，Efaroxan亦有可能是通过cAMP信号通路发挥对胰岛素分泌的调控作用。

进一步的研究表明，KU14R自身对胰岛素分泌没有影响，但可以抑制IBMX对胰岛素分泌的促进作用。IBMX是磷酸二酯酶抑制剂，可以抑制磷酸二酯酶对cAMP的降解作用[8]，从而提高细胞内的cAMP含量，进而促进胰岛素分泌。因此本实验进一步证明，KU14R是通过阻断药物对cAMP信号通路的激活来发挥抑制胰岛素分泌的作用，提示Efaroxan的促胰岛素分泌作用与cAMP信号通路有关。

在胰岛β细胞，cAMP的生物作用主要是通过其下游的蛋白激酶A(PKA)和Epac (exchange protein directly activated by cAMP) 效应物来完成[9-11]。通过检测胰岛cAMP含量，我们发现forskolin和IBMX的确明显增加了cAMP含量，但是Efaroxan和KU14R对胰岛cAMP含量没有影响，表明Efaroxan是通过激动cAMP下游信号通路发挥作用的，而KU14R也是通过阻断cAMP下游信号转导通路发挥抑制Efaroxan、forskolin和IBMX的促胰岛素分泌作用。

综上所述，本研究证明了Efaroxan具有葡萄糖依赖性促进胰岛素分泌的作用，其作用机制与胰岛β细胞cAMP下游信号通路有关。进一步的研究需要证实Efaroxan与cAMP下游信号分子PKA和Epac的关系。本研究为深入理解Efaroxan的促胰岛素分泌调控机制提供了理论依据。

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Effects of efaroxan on insulin release from pancreatic β cells

ZHANG Yi1, LIU Yun-feng2, GAO Jing-ying1，Ding Ya-qin1

(1.DeptofPharmacology; 2.DeptofEndocrinologyoftheFirstHospital,ShanxiMedicalUniversity，Taiyuan030001，China)

Aim To study the insulinotropic effects of Efaroxan and the underlying mechanism in rat β cells. Methods Pancreatic islets were isolated by collegenase p digestion. Radioimmunoassay was used to measure insulin secretion and cAMP level in rat pancreatic islets. Results Efaroxan only potentiated insulin secretion at high glucose concentrations(8.3，11.1 mmol·L-1) but not at low glucose concentrations. KU14R,an antagonist of Efaroxan, remarkably inhibited Efaroxan-potentiated insulin secretion; and similarly, KU14R significantly inhibited forskolin-induced and IBMX-induced insulin secretion. cAMP measurement showed that forskolin and IBMX significantly increased cAMP levels, but Efaroxan and KU14R had no effects on cAMP content in pancreatic islets. Conclusion The mechanism of Efaroxan-potentiated insulin secretion is related to downstream of cAMP signaling pathway, KU14R antagonized the downstream of cAMP signaling leading to its inhibitory effects on Efaroxan,forskolin and IBMX-induced insulin secretion.

Efaroxan; insulin; cAMP; KU14R；signal transduction; islet function

时间：2015-3-16 15:41 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150316.1541.025.html

2014-11-07,

2015-02-06

国家自然科学基金资助项目(No 81070662、81273564、81373464)；山西省自然科学基金资助项目(No 2012011039-8, 2013011047-3)；山西省高等学校优秀青年学术带头人支持计划(No 2011-24)；山西省留学人员科技活动项目择优资助；山西省回国留学人员科研资助项目(No 2012-046，2013-111)；山西省卫生厅科研课题(No 201201062)；中华医学会临床医学科研专项资金项目(No 13040440429)；人力资源和社会保障部择优启动项目(No 2013-277)

章 毅(1971-)，男，博士，教授，博士生导师，研究方向:内分泌药理学，通讯作者，Tel: 0351-4135132；E-mail：yizhang313@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.04.017

A

1001-1978(2015)04-0524-04

R-332；R322.57；R342.4；R347.8