西酞普兰对慢性应激大鼠额叶皮质神经细胞bax mRNA、bcl-2 mRNA表达及凋亡的影响*

俞爱月， 孙小红△， 刘学红， 周 瑾， 王 岚

(1. 绍兴文理学院元培学院， 2. 绍兴文理学院医学院， 浙江 绍兴 312000)



西酞普兰对慢性应激大鼠额叶皮质神经细胞bax mRNA、bcl-2 mRNA表达及凋亡的影响*

俞爱月1， 孙小红1△， 刘学红2， 周 瑾2， 王 岚2

(1. 绍兴文理学院元培学院， 2. 绍兴文理学院医学院， 浙江 绍兴 312000)

目的：探讨西酞普兰对慢性应激大鼠的额叶皮质神经细胞bax、bcl-2 mRNA表达的影响。方法：取24只雄性SD大鼠随机分为对照组(不进行任何处理)、应激组(应激+生理盐水灌胃)、实验组(应激+西酞普兰灌胃)，采用强迫游泳制造慢性应激模型(15 min/d，共4周)，用原位杂交技术检测bax、bcl-2 mRNA表达情况，TUNEL法检测细胞凋亡，尼康图像分析(NIS DR)软件测量各指标阳性细胞数量。结果：应激组较对照组，大鼠额叶皮质bax mRNA阳性表达细胞明显增多(P<0.01)、染色加深；bcl-2 mRNA阳性表达细胞明显减少(P<0.01)且染色变浅，且TUNEL阳性细胞数量增多(P<0.01)，染色增强。而实验组较应激组大鼠，额叶皮质bax mRNA阳性表达细胞减少(P<0.01)、染色变浅，bcl-2 mRNA阳性表达细胞明显增多(P<0.05)，染色加深，且TUNEL阳性细胞数量减少(P<0.01)，染色减弱。结论：大鼠额叶皮质神经细胞bax mRNA和bcl-2 mRNA的表达水平受到慢性应激的影响，导致细胞凋亡加剧，西酞普兰能够有效调控额叶皮质神经细胞bax和bcl-2 mRNA的表达水平，拮抗细胞凋亡，这可能是西酞普兰防治慢性应激引起的神经精神疾病的相关机制之一。

西酞普兰；慢性应激；bax mRNA；bcl-2 mRNA；细胞凋亡；额叶皮质；大鼠

慢性应激能够改变大脑皮质神经细胞形态结构及功能状态，并且与抑郁障碍的发生密切相关[1,2]。据报道，这与额叶皮质神经细胞的萎缩与凋亡相关

联[3]，其作用机制可能与脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)的下调、睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)及其mRNA下降、c-fos/c-jun、一氧化氮(NO)、过多自由基、细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2) 过磷酸化及超微结构的变化 、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)表达水平改变有关[4-7]。研究表明，银杏叶提取物、苯妥英钠、帕罗西汀、文拉法辛等药物对慢性应激大鼠大脑神经细胞具有保护作用[8-10]。西酞普兰是消旋二环phthalane衍生物，是一种新颖的选择性5-羟色胺(serotonin ,5-HT)的再摄取抑制剂，临床证明对抑郁障碍有较好的治疗效果。另有实验证明，西酞普兰可通过促进慢性应激大鼠海马BDNF表达及海马CA1区树突长度、分支及树突棘密度，改善学习记忆能力，并改善大鼠的抑郁行为，对大鼠神经细胞具有保护作用[11-14]。然而西酞普兰拮抗额叶皮质神经细胞凋亡的详尽机制，目前尚未见报道。本研究对西酞普兰干预慢性应激引起的额叶皮质神经细胞凋亡的机制作进一步研究，探索相关基因bcl-2 mRNA、bax mRNA表达与细胞凋亡的关系，为临床上慢性应激为诱因的神经精神类疾病的有关防治提供相应的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

SD雄性大鼠(浙江中医药大学实验动物中心提供；绍兴文理学院生命科学院实验基地动物室饲养)24只，体重(239±22)g；氢溴酸西酞普兰 (西安杨森制药有限公司生产)；检测细胞凋亡脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling，TUNEL)所用试剂均由北京中杉金桥生物技术有限公司提供，美国罗氏公司制造。bax、bcl-2原位杂交试剂，购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠饲养及造模 SD大鼠24只，随机分为3组(n=8)。分组分笼饲养，每笼4只，共6笼。自由进食饮水，适应期为7 d，进入实验程序。饲养环境为光/暗各12 h，光照时间为7∶00-19∶00，室温(23±2.0)℃。对照组不进行任何处理；应激组与实验组大鼠置于水缸(70 cm×70 cm×80 cm)中强迫游泳15 min/d，其水温(23.0±2.0)℃、水深25 cm，4周后制成慢性应激大鼠模型。同时4周内应激组每日采用等体积生理盐水灌胃，实验组以氢溴酸西酞普兰(4 mg/kg·d)灌胃预防性用药。

1.2.2 标本制备 实验过程第29天，使用戊巴比妥钠(2%，65～70 mg/kg)腹腔麻醉大鼠后，开胸经左心室快速灌注120～160 ml的生理盐水(37℃，含适量肝素)。然后使用210～250 m1中性多聚甲醛溶液灌注(4%，pH 7.4，磷酸盐缓冲液配制，含1/1 000的DEPC),时间30～45 min，取大鼠前脑组织于4%中性多聚甲醛溶液中固定40 min。包埋(常规石蜡)，切片4～6 μm。

1.2.3 原位杂交 常规脱水、浸蜡、包埋，室温持续5～10 min用于灭活内源性酶，蒸馏水洗重复3次，使mRNA核酸片段暴露；加2滴浓缩型胃蛋白酶于1 ml 3% 柠檬酸内，充分混匀，于切片上滴加，室温或37℃下消化15 min。原位杂交：PBS重复洗3次，持续时间5 min，蒸馏水洗1次，固定持续时间10 min：固定液为1%多聚甲醛/0.1 mol/L PBS(pH 7.4)，含有1/1 000 DEPC，蒸馏水洗3次,40℃恒温箱内预杂交4 h，吸去多余液体；不漂洗的每张切片滴25 μl杂交液，于40℃恒温箱内杂交过夜。杂交后洗涤：37℃水温的2×SSC洗涤5 min×2次；37℃ 0.5×SSC洗涤15 min×2次；37℃ 0.2×SSC洗涤15 min×1次；滴加封闭液：37℃下孵育30 min，滴加生物素化鼠抗地高辛，37℃下孵育60 min，PBS洗5 min×4次,滴加SABC，37℃下孵育20 min，PBS洗5 min×4次，滴加生物素化过氧化物酶，37℃下孵育20 min，PBS洗5 min×5次，DAB显色，苏木素轻度复染，脱水，透明，封片。镜下bax、bcl-2 mRNA的细胞胞浆着色呈黄色或棕黄色。

1.2.4 TUNEL法 切片常规脱蜡至水，微波技术进行修复(5 min)，3%双氧水阻断内源性过氧化物酶，加试剂1和2混合液(1∶9)，湿盒中保持37℃状态(60 min)，滴加转化剂-POD保持37℃状态维持30 min，DAB显色，苏木精轻度复染,中性树胶封片，光镜观察。判断阳性细胞是否凋亡的标准如下：细胞核呈浓缩状态，月牙形或不规则形、圆或椭圆形；颜色深浅程度不一致，多为黄色或棕色。阳性对照采用已知阳性片，采用标记液做阴性对照。

1.2.5 图像分析 用NIS DR(日本尼康图像分析，Nikon imaging software DR)软件处理并统计TUNEL阳性细胞数量和灰度值，细胞bax mRNA及bcl-2 mRNA的表达情况。每只大鼠取切片2张，光镜下每张选取额叶皮质2-3个视野(×400)进行统计。

1.3 统计分析

2 结果

2.1 各组大鼠bax mRNA、bcl-2 mRNA表达的变化

阳性细胞胞质呈浅黄色或黄色。应激组较对照组bax mRNA表达阳性细胞明显增多且染色深，而实验组较应激组bax-2 mRNA表达阳性细胞减少且染色浅；应激组较对照组bcl-2 mRNA表达阳性细胞明显减少且染色变浅，而实验组较应激组bcl-2 mRNA表达阳性细胞明显增多且染色深(图1，见彩图页Ⅱ)。

2.2 TUNEL法检测细胞凋亡情况

应激组与对照组进行比较,视野内阳性细胞体积显著减小。细胞核呈浓缩状态，形状多为月牙形、椭圆形或不规则形；颜色呈棕黄色或黄色，能够明显看到大量凋亡小体，实验组观察视野下阳性细胞数量较少，胞核呈浓缩状态的现象明显减少，染色程度均有不同程度降低(图2，见彩图页Ⅱ)。

2.3 额叶皮质bax mRNA、bcl-2 mRNA表达阳性细胞数比较

与应激组比较，对照组和实验组大鼠额叶皮质bcl-2 mRNA表达阳性细胞数量增加，bax mRNA、TUNEL表达阳性细胞数量减少，差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01, 表1)。

GroupbaxmRNAbcl-2mRNATUNELControl10.37±4.2124.33±6.7516.94±6.46Stress50.45±10.42**9.01±4.13**31.69±19.89**Experimental25.19±8.07##21.6±8.72#17.31±5.41##

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsstress group

3 讨论

采用强迫游泳方法建立大鼠抑郁应激模型，属于建模中的经典方法，广泛应用于抗抑郁药疗效评定及应激相关研究中[15]。我们的实验研究也成功制造了慢性应激大鼠模型，也提示西酞普兰能够拮抗应激造模所产生的体力不足状态和心理抑郁情况[16]。

细胞程序性死亡是一个主动的、完整的、受相应基因调控的细胞死亡过程,该过程分为激活、传递、凋亡三个阶段，其中基因及其表达蛋白调控是中间过程，而凋亡是程序性死亡的最后阶段[17]。bcl-2基因家族，是与细胞凋亡关系密切的原癌基因之一,其中bax为凋亡促进因子，bcl-2是凋亡抑制因子。本研究结果显示：应激组和对照组进行比较，其大鼠额叶皮质神经细胞的bcl-2 mRNA表达的阳性细胞染色变浅且数量明显减少，bax mRNA表达阳性细胞染色增强且数量明显增多，且TUNEL阳性细胞数量增多染色增强(细胞出现核缩，多为月牙形、椭圆形或不规则形，染色呈棕黄色或黄色，出现大量凋亡小体)，提示慢性应激可通过调控bax mRNA、bcl-2 mRNA，促进细胞凋亡；而实验组较应激组，大鼠额叶皮质神经细胞bax mRNA表达阳性细胞减少且染色浅，bcl-2 mRNA表达阳性细胞明显增多且染色深，且TUNEL阳性细胞数量减少染色减弱，提示西酞普兰可通过对bax mRNA、bcl-2 mRNA调控，拮抗细胞凋亡。结合本室的前期研究结果(应激组大鼠额叶皮质神经细胞bax蛋白表达的阳性细胞数量增多且细胞染色程度增强、bcl-2蛋白表达的阳性细胞数量减少且染色程度有所减轻；而使用西酞普兰组大鼠额叶皮质神经细胞bax蛋白表达阳性细胞减少且染色变浅、bcl-2蛋白表达阳性细胞增多且染色变深)[18]，综上，西酞普兰通过影响bax/bcl-2基因，调节控制相应的bax/bcl-2蛋白表达，从而影响相应的细胞凋亡。

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Effects of Citalopram on frontal cortical neurons’ bax mRNA、 bcl-2 mRNA expression and cell apoptosis of rat after stress

YU Ai-yue1, SUN Xiao-hong1△, LIU Xue-hong2, ZHOU Jin2, WANG Lan2

(1. Yuanpei College, Shaoxing University, 2. Medical College, Shaoxing University, Shaoxing 312000, China)

Objective: To study the effects of Citalopram on the mRNA expression of bax and bcl-2 in frontal cortical neurons and on cell apoptosis of rats after stress. Methods: Twenty-four healthy male SD rats were randomly divided into three groups (n=8). The control group did no receive any treatment, the stress group was subject to stress and given normal saline and experimental group was given Citalopram irrigation stomach after stress. Rats were forced to swim to establish chronic stress model (15min/d,4 weeks), bax、bcl-2 mRNA expression were tested by in situ hybridization technique (ISH), TUNEL assay was used to determine cell apoptosis , Nikon image analysis software were used to measure the number of positive cells in each index. Results: Compared with the control group, the stress group showed a larger number of bax mRNA expressing cells(P<0.01), a smaller number of bcl-2 mRNA expressing cells (P<0.01), and the staining intensity of positive cells was significantly reduced(P<0.01). Compared with the stress group, the experiment group showed more reduced number of bax mRNA positive cells(P<0.01)and significantly increased bcl-2 mRNA positive cells(P<0.05) , a small amount of positive cells were found, compared with that in the stress group, nuclear condensation in the experimental group was reduced significantly and the staining was obviously weaker(P<0.01). Conclusion: Citalopram significantly antagonizes bax mRNA and potentiatesbcl-2 mRNA protein expression and inhibits apoptosis of rat prefrontal cortical neurons caused by chronic stress, which might be one possible mechanism of Citalopram for prevention and treatment of psychosis caused by chronic stress.

Citalopram; chronic stress; bax mRNA; bcl-2 mRNA; apoptosis; prefrontal cortex; rat

浙江省绍兴市2010重点科研项目(2010A23019)

2015-02-26 【修回日期】2015-06-11

R363

A

1000-6834(2015)05-455-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.05.018

△【通讯作者】Tel： 0575-88348545； E-mail： 237062814@qq.com