冰冻人血清中黄体酮成分分析标准物质的研制*

刘 照 戴新华 李孟婉 李红梅 暴海霞 江 游

(中国计量科学研究院，北京 100029)



冰冻人血清中黄体酮成分分析标准物质的研制*

刘 照 戴新华 李孟婉 李红梅 暴海霞 江 游

(中国计量科学研究院，北京 100029)

本文介绍了研制的冰冻孕妇血清中黄体酮成分分析标准物质。采用超高效液相色谱-同位素稀释质谱法(UPLC-ID-MS/MS)对孕妇血清中黄体酮含量进行了测量，其定值结果为21.89ng/g。同时采用美国NIST标准物质和气相色谱-同位素稀释质谱法进行了定值验证，结果表明定值准确。对该标准物质进行了均匀性检验和稳定性监测，实验结果表明，其均匀性和稳定性检验结果均符合国家一级标准物质技术要求。

黄体酮；血清；标准物质；超高效液相色谱-同位素稀释质谱

0 引言

黄体酮是人体内重要的性激素之一，对维持女性正常生理周期和生理功能、调节人机体代谢有重要意义。女性血清孕酮水平随生理周期的不同而有明显的变化，一般为l～60ng/mL[1]，男性一般在0.1～0.2ng/mL之间。临床上测定血清孕酮主要用于黄体功能的判断和异常妊娠的诊断。其测定的常规方法主要为免疫分析法[2]，但受校准和方法特异性等原因，不同方法间结果的变异往往比较大，需要可靠的方法和标准物质实现其测定的标准化。为了满足临床实验室检测的实际需要，本工作研制了孕妇血清中黄体酮成分分析标准物质。

针对冰冻人血清中黄体酮成分分析标准物质的研究，目前国内尚未有文献报道。本文利用UPLC-ID-MS/MS[3-4]，采用单点法校正[5]，根据国家一级标准物质技术规范[6-7]的要求，对冰冻孕妇血清中黄体酮进行了定值、均匀性和稳定性的考察，同时对定值结果进行了不确定度评定。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

超高效液相色谱-质谱联用仪：TQS，美国waters公司；天平1：METTLER TOLEDO UMX2(Max=2.1 g，d=0.1μg)，德国梅特勒公司；天平2：ME235S(Max=230g，d=0.01mg)，德国赛多利斯公司；移液器：200μL和1000μL，德国；氮气吹干装置：BF-2000A，八方世纪公司。

黄体酮纯度标准物质[8]：GBW(E)110119，纯度99.20%，不确定度为0.5%(中国计量科学研究院)；黄体酮标记物：3,4-13C2,纯度90%(美国剑桥同位素实验室)；甲醇、乙腈和乙酸乙酯：高效液相色谱级(德国Merck公司)；高纯水，Millipore，18MΩ·cm；甲酸：质谱级(美国Sigma公司)。

1.2 样品采集

标准物质研制所需的血清样品由安贞医院和军事医学科学院提供，按照国家标准物质技术规范[6-7]的要求对备用原料进行过滤、混匀、分装，具体制备工作由军事医学科学院野战输血研究所承担。最终原料孕妇血清采用5mL冻存管包装，每支血清量2.5mL，在-70℃下冰冻保存。

1.3 样品前处理

1.3.1 标准储备溶液与工作标准溶液的配制

配制采用重量法。将一定量的黄体酮纯度标准物质和同位素内标分别溶于一定量的甲醇中，配制成浓度为1000μg/g的标准储备液(-20℃保存)。配制工作标准溶液时用流动相逐级稀释至与血清中黄体酮的浓度接近，把两种溶液按照浓度比值为1:l混合均匀，作为加标工作标准溶液，血清样品中也按照黄体酮与内标物的浓度比值为1:1加入内标溶液。

1.3.2 血清样品的预处理及其均匀性检验

血清属于复杂基体，尤其是黄体酮含量较低，因此，需要萃取、净化和浓缩等复杂的前处理技术。溶剂萃取和除蛋白质方法有多篇文献报道[4,5,9]，本实验采取了固相萃取(SPE)法[3]从血清中富集黄体酮。准确称取500μL血清于10mL离心管中，等比例加入黄体酮标记溶液，分别称量其质量。1)血清样品用6mL0.5mol/L的磷酸酸化，在室温下平衡1h；2)用SPE柱分离，先用5mL甲醇和5mL水先后活化SPE柱，以3～4mL/min的速度加样品溶液，再用12mL水和5mL水/乙腈(80：20体积比)洗涤，最后用2mL甲醇洗脱；3)洗脱液在40℃下氮气吹干，用0.5mL水复溶后用1mL乙酸乙酯再萃取两次，将两次萃取液合并，在40℃下氮气吹干；4)用流动相复溶到原来浓度，充分涡旋振荡，经0.22μm膜过滤，供UPLC-MS/MS测定。

根据JJG 1343—2012一级标准物质技术规范的要求[7]，从孕妇血清样品中随机取样11瓶。每一瓶均独立取3个子样。每个子样测量3次，作为瓶内的均匀性，每瓶的平均值作为瓶间的均匀性。

1.3.3 样品的稳定性考察

按照标准物质研制技术规范[6-7]的要求，考察了样品在-70℃下的长期稳定性、不同温度下和冻融性实验等的短期稳定性。

样品在-70℃下的稳定性，按先密后疏的原则，在定值后的第1、3、6月份分别采用UPLC-MS/MS方法抽样检测其含量的变化。每次取2个样品，每个样品取三个子样，测3次，取平均值。根据规范标准物质定值的通用原则及统计学原理的要求[7]对稳定性监测数据用t检验法[6-7]进行计算和稳定性评估，结果的变动在定值结果不确定度范围内作为判定标准物质稳定的原则。

1.4 样品的定值方法

在本研制中，采用UPLC-ID-MS/MS法进行标准物质的定值，并以GC-IDMS方法[5,9]进行定值验证。

1)色谱条件:色谱柱：ACQUIT UPLCBEH C18柱(2.1×50mm，1.7μm)，流动相的组成：水(含0.1%的甲酸)：甲醇=40：60，流速：0.4mL/min，进样量：5.0μL，样品盘温度为：10℃。

2)质谱检测条件：采用电喷雾离子源(ESI)对样品进行离子化，在正离子模式下进行扫描，毛细管电压：3.00kV；锥孔电压：30V；离子源温度：150℃；氮气压力：7.0×105Pa；碰撞气流速：0.15mL/min；数据采集时间：7min。采用多反应离子监测(MRM)方式，黄体酮和黄体酮同位素内标物的母离子分别为m/z315.3和317.3，选择相应的子离子m/z97.0和99.0作为定量离子(如图1)。

图1 UPLC-ID-MS/MS法测定血清黄体酮和内标物的选择离子流图

2 结果与讨论

2.1 最小取样量结果

分别称取孕妇血清500μL、400μL、300μL、200μL、100μL、50μL，按照1.3中方法进行前处理，采用UPLC-ID-MS/MS测定黄体酮含量。测得黄体酮含量基本一致，因此，采用RSD值为判定标准，当RSD值大于2.0%时，判断该取样量太小，不符合要求，最终得到本实验的最小取样量为100μL，考虑到不同仪器灵敏度和重复性差异，建议实际定值时取样量为500μL。

2.2 检出限和定量限的测定

按照实验部分，对血清进行相应的前处理和测定，进样体积为5μL。逐级稀释样品，当信噪比(S/N)为3时，得到血清中黄体酮的检出限为1.2×10-13g。采用同样方法，当信噪比(S/N)为10时，得到血清中黄体酮的定量限为4×10-13g。

2.3 样品定值结果与均匀性检验

血清中黄体酮浓度采用单点法[5]进行计算，测量结果见表1。

2.4 稳定性考察结果

血清稳定性考查结果见表2。

从表2数据分析可知，血清中黄体酮在-70℃下保存六个月，其稳定性经t检验良好。

2.5 方法验证

为了验证所研制的血清样品中黄体酮定值结果的准确性，我们采用美国国家标准与技术研究院(NIST)的SRM971和GC-ID/MS[5,9]法对标准物质进行定值验证。

表2 血清黄体酮长期稳定性考查结果

2.5.1 采用NIST血清进行定值验证

采用同样的定值方法对NIST血清标物SRM971进行测定，平行测定两次，测定值为1.941ng/g(RSD为0.45%)，在其不确定范围内(1.835～1.971ng/g)，表明血清中黄体酮定值结果是准确可靠的。

2.5.2 采用GC-ID/MS进行定值验证

为了进一步验证该定值结果的准确性，同时采用气相色谱同位素稀释质谱(GC-ID/MS)衍生化法[5,9]对孕妇血清进行了测量。前处理过程与UPLC-ID-MS/MS方法一致，洗脱完成后采用七氟丁酸酐进行衍生化反应，衍生反应完成后所得产物用环己烷溶解，进行GC-MS测量，其结果为21.673ng/g(RSD=0.17%)，与该标准物质标准值的相对偏差为0.986%，且在不确定度范围内，充分证明了该标准物质定值结果的准确性和可靠性。

2.6 测量结果不确定度的评定

根据ISO、EURACHEM导则、测量不确定度评定与表示[7]，对血清中黄体酮结果的不确定度进行了评定。

2.6.1 不确定度来源分析

标准物质定值结果的不确定度由标准物质的不均匀性引入的不确定度ubb，标准物质的不稳定性引入的不确定度uls以及标准物质定值过程带来的不确定度uchar三部分组成。将上述三部分不确定度分量合成，得标准物质的合成标准不确定度uCRM：

(1)

2.6.2 不确定度的量化

1)标准物质定值的不确定度分别由仪器测量重复性引入的A类不确定度、天平称量和纯品标准物质引入的B类不确定度合成得到，记为uchar，则计算如下：

=0.844%

2)均匀性引入的不确定度，采用方差分析法进行计算，得到标准物质均匀性引入的相对不确定度，ubb=0.174%。

3)稳定性引入的不确定度，血清中黄体酮稳定性考察结果表明，血清中黄体酮在考察期间是稳定的。同时通过线性拟合，得到标准物质稳定性引入的不确定度uls=0.670%。

2.6.3 不确定度的合成

通过上述方法得到不确定度的各分量，按照式(1)将各个分量合成(见表3)得到血清中黄体酮含量的合成标准不确定度为0.48ng/g。

表3 血清中黄体酮成分分析标准物质的标准值和不确定度

3 结论

本项目采用UPLC-ID-MS/MS对血清中黄体酮成分分析标准物质进行定值，与国外方法相比，缩短了分析时间，提高了工作效率，而且避免了复杂费时的衍生化反应，定值技术达到国际先进水平。

均匀性检验和长期稳定性监测结果表明：血清中黄体酮成分分析标准物质均匀性良好，符合国家一级标准物质对稳定性的要求，同时该标准物质的研制填补了国内该项空白，完善了临床黄体酮检测溯源的参考系统。该标准物质可用于血清黄体酮检测分析方法的评价、分析过程的质量控制以及对实验室能力的考核。同时为我国临床医学检验、卫生检验检疫等方面的测量和研究工作提供技术支撑和量值溯源保障。

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*国家科技基础专项(2011FY130100)、国家科技支撑计划(2013BAK10B01)和国家重大科学仪器设备开发专项(2011YQ06008403)