沈卫锋,孟智启,蔡磊明
1.浙江省农业科学院蚕桑研究所,杭州 310021 2.浙江省农业科学院农产品质量标准研究所,杭州 310021
家蚕
——新的内分泌干扰物筛选靶标
沈卫锋1,孟智启1,蔡磊明2,*
1.浙江省农业科学院蚕桑研究所,杭州 310021 2.浙江省农业科学院农产品质量标准研究所,杭州 310021
内分泌干扰物对人类及环境的影响日益严重,如何建立快速有效的筛选方法,从复杂的周围环境中鉴别出具有内分泌干扰活性的物质,指导人们尽量规避不必要的暴露风险,成了当前环境学家的重要任务。本文以鳞翅目昆虫的模式物种家蚕为对象,介绍了其内分泌系统组成及相关激素的作用,分析了作为内分泌干扰物筛选靶标的优势,阐述了候选的测试端点及依据,从理论和方法不同角度探讨了家蚕成为一种新的内分泌干扰物筛选靶标的可行性。
内分泌干扰物;家蚕;筛选靶标
内分泌干扰物(endocrine disrupting chemicals, EDCs)是一类广泛存在于环境、食物以及消费品中的可以对生物体内激素水平产生影响的物质。如何快速、有效地从成千上万的可疑物质中筛选出对生物体内分泌系统确实具有干扰作用的化学物质已成为生态毒理学、环境科学等研究领域的当务之急。
对于内分泌干扰物筛选靶标动物的选择,要遵循以下原则:①实验动物易于获得并易于在实验室培养;②实验动物生长迅速,生活周期短;③实验动物的基础生物学研究比较深入,前期研究实验数据较丰富;④实验动物具有完备的内分泌系统,其生长、发育、繁殖均受激素调控[1]。目前常用的内分泌干扰物筛选动物靶标有:啮齿类(大、小鼠)、鱼类(黑头呆鱼、日本青鳉)、两栖类(非洲爪蟾)等。昆虫是动物界中最大的一个类群,是无脊椎动物门的代表,无论从个体数量、生物数量、种类与基因数来讲,都在生物界中占有十分重要的地位。鳞翅目是昆虫纲中的第二大目,其中家蚕(Bombyx mori)作为鳞翅目昆虫的模式物质,是我国特有的经济昆虫,有着五千多年的饲养历史。家蚕能否被开发成一种全新的内分泌干扰物筛选靶标动物,将在下文中进行详细探讨。
1.1 内分泌系统组成
家蚕的内分泌腺体包括脑神经分泌细胞、咽下神经节、前胸腺、咽侧体和胸腹部神经节分泌细胞,主要分泌脑激素、滞育激素、蜕皮激素、保幼激素等。它们通过各自靶器官与家蚕的生长发育、生殖、代谢等生命活动密切相关,组成一个完整的内分泌系统(图1)[2]。
图1 家蚕内分泌腺体及其相互作用[2]Fig. 1 Endocrine glands and interactions of silkworm[2]
1.1.1 保幼激素(juvenile hormone, JH)
家蚕的保幼激素是由咽侧体糙面内质网合成的一类具有环氧基结构的激素,目前已知有3种结构类似物,分别为:JH-I、JH-II、JH-III,后两种为鳞翅目昆虫特有。JH具有保持家蚕幼虫形态,阻止成虫器官芽发育的作用。当JH分泌量少或停止分泌时,脂肪体内大量积累蛋白质,丝腺迅速生长,当蚕体内没有JH存在的情况下卵巢才能迅速长大[3-4]。可见,JH能促进DNA合成,相反抑制了RNA和蛋白质的合成。
1.1.2 蜕皮激素
家蚕的蜕皮激素(molting hormone, MH)是由前胸腺合成的一类甾体化合物,目前已知有2种:α-MH、β-MH,其分泌受脑激素的控制,脑激素分泌前,前胸腺无分泌活性。家蚕MH的功能如下:第一,激发新表皮形成和旧表皮脱下;第二,促进RNA和蛋白质的合成,其中包括与生殖发育相关的卵黄原蛋白;第三,增强细胞的呼吸作用,使得线粒体数量和体积增加[2-4]。
1.1.3 滞育激素
家蚕的滞育激素(diapause hormone, DH)是由咽下神经节分泌的一类多肽激素,由15种氨基酸组成,目前已知有2种:DH-A、DH-B。家蚕DH的功能是控制蚕卵的滞育特性,提高卵巢膜和卵膜的透性,影响卵内糖、脂质和蛋白质的代谢方向等[5-6]。
1.1.4 脑激素
家蚕脑激素的种类比较多,包括:促前胸腺激素(pmthoracicotropic hormone, PTTH)、鞣化激素、羽化激素、利尿激素等。PTTH是一种神经多肽物质,氨基酸序列与人胰岛素具有同源性,其中与胰岛素A链的1-20位和类胰岛素生长因子Ⅰ的42-60位相同[7],其作用是活化前胸腺,使其产生MH,同时抑制咽侧体活性;鞣化激素能使幼虫腹部表皮鞣化、着色;羽化激素在从蛹到蛾的发育过程中产生,并在羽化前约40 min释放到家蚕血液中,控制蛹的羽化行为;利尿激素的作用是促进马氏管从血液中吸取水分,以保持正常的血液渗透压[2]。
1.2 内分泌激素对生理的调节
1.2.1 对生长发育的调节
在家蚕的生长发育过程中,JH、MH、脑激素的分泌活性呈现周期性交替变化。从蚁蚕开始,各龄前期咽侧体分泌JH旺盛,促进了体细胞的迅速增大;各龄中期脑激素短暂分泌,活化了前胸腺分泌MH,同时抑制了JH,促使细胞充实、分裂和分化,达到一定程度后即可诱导幼虫蜕皮。如此反复循环,经历4次蜕皮,幼虫显著长大(图2)[2-3]。由此可见,JH对幼虫的生长起主导作用,MH对幼虫的发育起主导作用,两者均受脑激素的调控。
图2 保幼激素(JH)和蜕皮激素(MH)分泌相[2-3]Fig. 2 Secretory profile of juvenile hormone (JH) and molting hormone (MH)[2-3]
1.2.2 对生殖的调节
家蚕卵巢的生长及卵的发育、成熟主要在蛹期完成,因此成虫在羽化后不需要取食即可进行交配。一般认为,JH与卵的成熟发育相关,对增加产卵量有一定的作用,但对精母细胞的成熟分裂和精子的形成有抑制作用;MH则能促进卵巢发育、卵黄蛋白的合成,同时也是精子形成的必要条件。
1.2.3 对蚕卵滞育的调节
家蚕是以卵滞育的昆虫,咽下神经节所分泌的DH是调控蚕卵滞育的主要激素。DH通过对碳水化合物、蛋白质、脂质、色素等物质代谢的调节,从而引发蚕卵的滞育特性[6]。蚕卵的滞育是当其在卵巢内发育时就已决定,而非在卵产下后。
1.2.4 对丝腺蛋白生长的调节
当幼虫体内存在大量JH时,促进DNA合成;当MH起主导作用时,促进RNA的合成,使丝腺组织迅速增大,大量蛋白质充满丝腺腔体,随后老熟幼虫吐丝化蛹[4,8]。化蛹后咽侧体不分泌JH,丝腺组织最终被解离。
1.3 控制激素的基因
关于家蚕体内与激素分泌相关基因的研究不多,主要有:性成熟基因Lm(迟熟)、Lme(早熟);眠性基因M3(3眠)、+M(4眠)、M5(5眠);化性基因V3(多化)、+V(2化)、V1(1化)。
2.1 实验动物易于获得并易于在实验室培养
众所周知,家蚕在我国有着悠久的饲养历史,也是目前饲养规模最大的昆虫。传统家蚕饲养因饲养地的气候限制,每年大多1~3代,两广等热带地区可达5~6代。为了解决气候条件对饲养的限制,20世纪60年代,日本蚕学家进行家蚕全龄人工饲料育试验探索并获得了成功[9]。我国从70年代起开展了家蚕人工饲料研究,近40年不间断地研究积累了丰富的实验资料与饲育经验[10-11],培育了一批人工饲料适食性较好的家蚕品种,能够为筛选试验全年无休地提供充足的材料蚕,完全符合实验动物易于培养获得的要求。
2.2 实验动物生长迅速,生活周期短
家蚕是完全变态的昆虫,其一生要经过卵、幼虫、蛹、成虫4个形态和机能上完全不同的发育阶段。从蚁蚕孵化到成虫产下卵,整个过程大约只需经历40~45 d。而目前常用的内分泌干扰物筛选靶标动物中,大鼠(Rattus norvegicus)需要6~8周达性成熟,3个月达体成熟,寿命长达在3~5 a;黑头呆鱼(Pimephales promelas)需要饲养4.5~6个月才能作为筛选试材;非洲爪蟾(Xenopus laevis)在室内养殖条件下1~2 a才能达到性成熟,平均寿命更是长达5~15 a。因此,从动物个体的生长速度、生命周期而言,家蚕无疑具有成为新筛选靶标的巨大潜力。
2.3 实验动物的基础生物学研究比较深入,前期研究实验数据较丰富
从人类开始饲养家蚕以来,蚕学就被当成一门学科来研究,内容包括:蚕体解剖生理学、遗传学、育种学、病理学、蚕丝生物学等,非常详实地记录了家蚕的分类、形态结构、生活习性、繁殖特征、遗传发育,以及其他有关的生命活动特征和规律。家蚕在生长发育过程中,其形态改变所对应的生理生化变化、器官发育与消解、激素水平变化等相关内容都有详细的研究。近年来,随着全基因测序及精细物理图谱绘制工作的完成[12-13],为蚕学这一古老的学科增添了新鲜血液,开启了人类从分子水平重新去研究家蚕的序幕。
2.4 实验动物具有完备的内分泌系统,其生长、发育、繁殖均受激素调控
和哺乳类(大、小鼠)、非哺乳类(如两栖类、鱼类)动物一样,家蚕也具有一套完整的内分泌系统。其内分泌腺体所分泌的多种激素,经血液运输至蚕体各部位,从而调控家蚕的一切生长、发育及生殖过程,包括:蚁蚕的孵化,幼虫的生长与蜕皮,老熟幼虫的吐丝结茧与化蛹,成虫的羽化、交配与产卵等行为。因此,家蚕具备了成为内分泌干扰物筛选靶标的基本条件。
根据家蚕体内各种激素对其生长、发育、生殖调控的机理,以下一些指标可作为测试端点的候选。
3.1 对各龄幼虫入眠、眠起时间的影响
JH与MH量的动态平衡控制了幼虫每一龄期所需要的时间。对于特定的家蚕品种,眠性由遗传因素决定,同时受到外界环境的影响。如果外源化合物干扰家蚕的内分泌系统,打破了JH与MH的平衡,势必会引起入眠、眠起时间的变化。因此,入眠和眠起时间可作为候选的测试端点。
3.2 对虫体色、成虫羽化能力、蚕卵滞育及化性的影响
JH能影响黑色素前驱物酪氨酸向外胚层组织转移,阻碍黑色素形成;羽化激素在成虫发育完成后被释放到血液中,一旦出现异常会造成羽化障碍;DH控制了卵的滞育特性,使家蚕需经过低温和时间的积累才可孵化。因此,可以观察外源化合物对这些指标的影响,分析作为测试端点的可能性。
3.3 对丝腺发育及全茧量、茧层量的影响
有研究表明,外源化合物会造成丝腺发育异常,影响全茧量、茧层量等茧丝指标。如,咪唑类化合物是保幼激素抑制剂,处理不同龄期的幼虫后,全茧量的变化范围为:62%~104%,茧层量为:56%~106%[2]。可见,丝腺发育指标可以作为候选的测试端点。
3.4 对生殖器官及生殖能力的影响
实验证明,雌蛾的产卵能力及卵的孵化能力受到脑、咽侧体、前胸腺所分泌激素的联合调控。一旦外源化合物侵入蚕体破坏各种激素的正常代谢,就会影响卵巢和精巢的组织特征以及成虫的繁殖能力。因此,雌蛾产卵能力、卵孵化率、后代性比等指标也可以作为测试端点的候选。
3.5 对幼虫血液组织基因表达、蛋白表达、物质代谢的影响
有研究表明,由脑合成的PTTH促进了前胸腺合成和释放蜕皮激素前体,在血液中转变成20-OH蜕皮酮(MH),启动一系列基因表达,调控幼虫蜕皮、羽化等级联反应,最终完成启动蜕皮、蜕皮、蜕皮后体壁鞣化等生理过程[2]。如果外源化合物与幼虫血液中的激素受体结合,一定会干扰正常的基因表达、蛋白合成,以及体内各类物质的代谢,通过对这些变化的分析,或许也可以找到相关的测试端点。
外源化合物在干扰机体内分泌系统的同时也引起了其它生理、生化、细胞等改变,测试端点的变化可能只是机体的一种暂时反应,也可能很多化学物质都会引起类似的变化,因此测试端点的特异性就显得尤为重要。很多研究者从试验现象出发所提出的测试端点往往在特异性方面有所欠缺,所以必须通过反复试验来确认其可靠性。另一方面,加强内分泌干扰机制研究也将为测试端点的确认提供理论依据。
昆虫属于节肢动物门,是无脊椎动物中最重要的一类,也是地球上数量最多的动物群体,是动物向鱼类、鸟类、哺乳类等更高级的脊椎动物模式进化的必经阶段。因此,研究外源化合物对昆虫的影响,是全面评价该物质对动物体影响的重要方面,是对脊椎动物评价结果的有力补充。目前现有的一些脊椎动物靶标,有的个体较大(大鼠),对于外源化合物的耐受能力相对较强,低剂量的内分泌干扰效应不容易被发现;有的饲养周期太长(非洲爪蟾),不太适合用作内分泌干扰累代效应的评价。家蚕由于长期以来的隔绝饲养,是一种对外源化合物很敏感的昆虫,再加上个体较小、生长周期短、易于获得的特性,非常适合用作外源化合物对动物体影响评价的靶标。袁红霞[14]评价了4-壬基苯酚对家蚕生殖系统的影响,通过调查性腺指数、产卵能力、子代孵化率、性腺的组织病理以及生殖发育关键基因的变化,筛选了可用于生殖毒性评价的生物标志物。但是,家蚕作为昆虫与哺乳动物在进化程度上有较大差异,如何将家蚕的内分泌干扰效应借鉴到哺乳动物甚至人类,还有待进一步的研究。
据估计,农药品种中大约70%~80%可能是内分泌干扰物。1999年世界自然基金会《环境中被报告具有生殖和内分泌干扰作用的化学物质清单》中共列举了125种环境内分泌干扰类物质,其中农药86种,占68.8%。截至2008年,报道的具有内分泌干扰效应的农药已达127种,农药对于环境、动物、人类直接以及潜在的危害,越来越受到人们关注。因此,建立一种快速、准确、有效的内分泌干扰效应评价体系迫在眉睫。基于上述特性,在农药类内分泌干扰物筛选评价领域,家蚕非常有希望成为优良的动物靶标。
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◆
Silkworm—A New Target for Endocrine Disrupting Chemicals Screening
Shen Weifeng1, Meng Zhiqi1, Cai Leiming2,*
1. Sericultural Research Institute, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China 2. Institute of Quality and Standard for Agro-products, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China
8 May 2014 accepted 10 July 2014
The influence of endocrine disrupting-chemicals (EDCs) on human and environment is becoming more and more serious. The challenging tasks for environmental experts are establishing an efficient and rapid screening method to identify the active EDCs from complex environment,and guiding people to avoid unnecessary exposure risk. The article introduces the composition of endocrine system and their associated hormones of silkworm (bombyx mori). The advantages of silkworm as an ideal candidate for testing EDCs and candidate measurement endpoints are detailed analysis. The feasibility of silkworm as a new EDC test species are also discussed from the perspective of theory and methods.
endocrine disrupting chemicals; silkworm (bombyx mori); screening target
浙江省重点科技创新团队项目(2011R50028-4);农业部农药残留检测重点实验室项目(2013PRG03)
沈卫锋(1977-),男,博士,研究方向为家蚕分子毒理学,E-mail: weifsh@126.com;
*通讯作者(Corresponding author), E-mail: cailm@zaas.org
10.7524/AJE.1673-5897.20140508002
2014-05-08 录用日期:2014-07-10
1673-5897(2015)2-154-05
X171.5
A
蔡磊明(1962—),男,理学博士,教授级高级工程师,主要从事农药、医药和精细化学品环境归宿、生物降解、残留、环境毒理学和环境风险评估等研究。
沈卫锋, 孟智启, 蔡磊明. 家蚕——新的内分泌干扰物筛选靶标[J]. 生态毒理学报, 2015, 10(2): 154-158
Shen W F, Meng Z Q, Cai L M. Silkworm-A new target for endocrine disrupting chemicals screening [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(2): 154-158 (in Chinese)