β-TCP对比格犬下颌骨中巢蛋白家族基因表达的影响

赵 剑 安孙子 宜 光

(1.天津市口腔医院牙体牙髓病一科，天津300041;2.日本大学松户齿学部生化学、分子生物学讲座)

β-TCP对比格犬下颌骨中巢蛋白家族基因表达的影响

赵 剑1安孙子 宜 光2

(1.天津市口腔医院牙体牙髓病一科，天津300041;2.日本大学松户齿学部生化学、分子生物学讲座)

目的以比格犬下颌骨人造骨缺损为模型研究β-磷酸三钙(β-TCP)对巢蛋白家族巢蛋白-1(nidogen-1)和巢蛋白-2(nidogen-2)基因表达的影响。方法在比格犬下颌骨前磨牙区制备的人造骨缺损中植入β-TCP，用RT-PCR法观察植入后第4、7、14天时植入区活体组织样本中nidogen-1和nidogen-2 mRNA的表达。结果与对照组相比，β-TCP组nidogen-1和nidogen-2第4天时mRNA电泳条带增强，第7天的mRNA电泳条带明显增强，14天时无明显变化。结论β-TCP对比格犬下颌骨中巢蛋白家族nidogen-1和nidogen-2的基因表达有促进作用。

β-磷酸三钙;巢蛋白;基因表达;比格犬

巢蛋白(nidogen)是构成基底膜的重要细胞外基质蛋白，目前已发现nidogen-1和nidogen-2两个巢蛋白家族成员，nidogen-1和nidogen-2在分布上有明显不同，nidogen-1更多的存在于哺乳动物中，Nidogen在皮肤、肌肉、肺和神经系统等多个组织的基板的超分子组结构中发挥中心作用［1］。当发生细胞侵入和组织迁移引起细胞外基质转化时，nidogen-1的蛋白水解可以触发基底膜的重构。研究表明，Nidogen与细胞膜上的肿瘤内皮标志7(TEM-7)结合有促进血管生成和稳定新生微血管的作用［2］。

作为一种生物降解材料，β-磷酸三钙(β-TCP)因其良好的生物相容性和骨传导性，被广泛地应用于骨缺损修复。β-TCP结构中含有磷酸钙基，当其植入活体缺损部位后，Ca、P离子能够降解进入循环系统形成新骨［3－4］。随着β-TCP合成技术的发展，学者们研究制备出力学性能优良的多孔β-TCP陶瓷，并将β-TCP与具有成骨能力的多种细胞因子结合制备出具有良好骨诱导能力和成骨特性的β-TCP复合支架材料［5］，作者先前的研究表明β-TCP可以促进比格犬下颌骨中Ⅰ型胶原α1(Col1A1)、碱性磷酸酶(ALP)、转化生长因子-β2(TGF-β2)等重要的成骨标志性蛋白的基因表达［6］，为研究β-TCP的成骨机制提供了实验依据，但有关β-TCP与巢蛋白关系的研究尚无报道，本实验以比格犬人造下颌骨缺损为模型，研究了β-TCP对巢蛋白家族nidogen-1和nidogen-2基因表达的影响，为从分子水平阐明β-TCP的骨诱导和骨形成机制提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物准备雄性驯化种比格犬3只由SLC公司提供，体重12～14千克，于日本大学松户齿学部实验动物中心饲养，饲养级别:清洁级。

1.2 比格犬人工下颌骨缺损制备、β-TCP植入及样本提取将3只比格犬单侧下颌第二、三前磨牙共6个位点随机分为β-TCP组和对照组。比格犬按1mg/kg的剂量，行静脉注射3%戊巴比妥钠麻醉，拔除第二、三前磨牙，自然愈合3个月后检查术区无异常，局麻下以直径4.5 mm，长8 mm的牙科种植钻头在原拔牙窝处制作人工骨缺损，对照组将粘膜缝合待创口自然愈合，实验组植入纯度大于99%的β-TCP-100(Taihe Chemicals Limited)后缝合粘膜。两组均术后立即肌注庆大霉素60 mg，术后3天每日肌注庆大霉素6 mg/kg。术区每日擦拭消毒，常规护理。术后3天进软食保护术区，3天后正常饮食。术后第4，7，14天时分别拆除缝线，剥离粘膜，用前述的牙科种植钻头取出创口内的活体组织。

1.3 RNA提取使用RNA提取套装(RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit Isolation System，Qiagen)按照说明书提取总RNA。用核酸定量仪测定RNA样本的浓度和吸光度(A)值，以A260/A280的比值来鉴定RNA样本的纯度。

1.4 RT-PCR法检测nidogen-1和nidogen-2 mRNA表达使用GeneAmp RNA PCR Kit(Applied Biosystems，USA)，将2.0μg总RNA用于RT-PCR反应，使用狗nidogen-1、nidogen-2和GAPDH三种引物，引物序列见表1。扩增条件:94°C，5 min预变性，然后按以下进行35个循环的扩增:94°C 30 s，55°C 30 s，72°C 30 s。最后72°C，5 min延伸。将各组的扩增产物经2%的琼脂糖凝胶中电泳后，溴化乙锭染色，紫外透视仪下观察结果、拍照、分析。

表1 RT-PCR引物序列

2 结果

β-TCP促进比格犬下颌骨中nidogen-1和nidogen-2的mRNA表达:RT-PCR扩增产物的凝胶电泳实验表明，将β-TCP植入比格犬下颌骨人造骨缺损4、7天后，β-TCP组nidogen-1和nidogen-2的mRNA的电泳条带较对照组均增强，其中第7天增强明显，14天时nidogen-1和nidogen-2无明显变化;作为标准对照的各组的GAPDH的mRNA电泳条带未见明显变化(图1)。

3 讨论

本研究以比格犬下颌骨人造骨缺损为模型，证明了β-TCP对Nidogen家族基因表达的促进作用。研究表明，Nidogen通过RGD序列结构(精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸)与细胞膜上的α3β1整合素受体结合可以调节细胞连接的稳定性，提示材料植入后的骨替代过程中，β-TCP刺激Nidogen高表达，后者可能通过与α3β1整合素受体结合来提高参与成骨过程细胞连接的稳定性，从而保证和促进细胞正常功能的行使，促进成骨过程［7］。

图1 β-TCP对Beagle犬下颌骨中nidogen-1和nidogen-2 mRNA表达的影响

Nidogen作为细胞外基质，其在β-TCP刺激下的高表达可能增加与内皮细胞的黏附，从而刺激新生血管的生成，促进骨改建过程。另外，研究表明，Nidogen与细胞膜上的TEM-7结合有促进血管生成和稳定新生微血管的作用，提示Nidogen可能通过这种机制来刺激血管生成从而促进成骨。

β-TCP是最早用作骨替代材料的钙磷化合物之一，被广泛应用于临床并取得了良好的效果，然而，有关β-TCP的研究多数集中在β-TCP的结构、复合材料的研制以及植入后的临床效果、体征的改善等［8］，从分子水平研究其促进骨形成和骨修复机制的报道尚不多见，本研究从基因水平探讨了β-TCP对成骨相关基因的作用，证明了比格犬下颌骨中β-TCP对Nidogen家族基因表达的促进作用，为研究β-TCP的骨替代机制提供了新的实验依据。

［1］Ho MSP，Bosc K，Mokkapati S，et al.Nidogens-Extracellular matrix linker molecules［J］.Microsc Res Tech，2008，71:387－395.

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［3］刘家祺，亓发芝.Beta-磷酸三钙复合材料的研究进展［J］.中国美容医学，2011，20(4):688－690.

［4］Liao F，Chen Y，Li Z，et al.A novel bioactive three-dimensional beta-tricalcium phosphate/chitosan scaffold for periodontal tissue engineering［J］.J Mater Sci Mater，2010，21(2):489－496.

［5］龚立，陈际达，揭芳芳.β-TCP的研究进展及其在骨科中的应用［J］.河北化工，2006，29(11):54－57.

［6］Zhao J，Watanabe T，Bhawal UK，et al.Transcriptome analysis of β-TCP implanted in dog mandible［J］.Bone，2011，48:864－877.

［7］Hong C，Noboru K.A biodegradable porus composite scaffold of PGA/β-TCP for bone engineering［J］.Bone，2010，46(2):386－395.

［8］史定伟，谢幼专，汤亭亭，等.β-TCP植入人体骨缺损后的组织学观察［J］.生物骨科材料与临床研究，2008，5(3):8－10.

Impact of β-TCP on nidogen gene expression in Beagle dog mandible

Zhao Jian1Abiko Yoshimitsu2
(1.Dept.of Endodontology，Tianjin Stomatology Hospital，Tianjin 300041; 2.Dept.of Biochemistry and Molecular Biology，Nihon University School of Dentistry at Matsudo)

Objective:To investigate the effects of β-TCP on nidogen family nidogen-1 and nidogen-2 gene expression in artificial bone defects of Beagle dog mandible.Methods:β-TCP were implanted into the artificial osseous defects for 4，7，and 14 days，and RT-PCR was performed to determine the mRNA levels of nidogen-1 and nidogen-2.Results:The mRNA levels of both nidogen-1 and nidogen-2 were up-regulated by β-TCP on day 4，evidently increased on day 7，no change was observed on day 14.Conclusion:β-TCP stimulates nidogen gene expression in Beagle dog mandible.

β-TCP;nidogen;gene expression;Beagle dog

R781

A

1004-7115(2015)05-0498-02

10.3969/j.issn.1004-7115.2015.05.005

2015-01-08)

赵剑(1982－)，女，博士，主治医师，主要从事口腔内科学工作。