响应面法优化牛膝中齐墩果酸超声波辅助提取工艺

赵明霞,欧阳杰,*

(1.北京林业大学生物科学与技术学院食品科学与工程系,北京 100083;2.林业食品加工与安全北京市重点实验室(北京林业大学),北京 100083)

响应面法优化牛膝中齐墩果酸超声波辅助提取工艺

赵明霞1,2,欧阳杰1,2,*

(1.北京林业大学生物科学与技术学院食品科学与工程系,北京 100083;2.林业食品加工与安全北京市重点实验室(北京林业大学),北京 100083)

以牛膝为原料,以齐墩果酸提取得率为指标,采用超声波辅助提取牛膝中齐墩果酸。分别研究了乙醇浓度、料液比、提取时间对齐墩果酸提取得率的影响,通过响应面实验优化了提取工艺。结果表明,齐墩果酸提取的较佳工艺条件是:乙醇浓度70%,提取时间20min,料液比(w/v)1∶20。在此条件下,齐墩果酸的提取含量为11.14mg/g。

牛膝,齐墩果酸,超声波辅助,提取工艺

牛膝(Achyranthesbidentata)为苋科牛膝属的植物,分布于非洲、东南亚以及俄罗斯、朝鲜、中国等地,生长于海拔200～1750米的山坡林下[1]。牛膝的主要功效为补肝肾、清热火,主治腰膝酸痛、下肢痿软、咽喉肿痛等[2-3]。现代医学证明,牛膝具有免疫调节、消炎抗菌、抑制肿瘤等作用[4-6]。在卫生部2009年公布的《药食同源品名单》中,牛膝被列入保健食品的物品名单。

齐墩果酸(Oleanolic acid)为五环三萜类化合物,是牛膝中最主要的活性物质之一[7-8]。齐墩果酸的提取方法主要有甲醇和乙醇超声提取并用大孔吸附树脂纯化,超临界CO2流体萃取技术等[9-11]。牛膝齐墩果酸具有较高的开发利用价值,它既可以用于药品,又可以用于功能食品和保健食品中[12-14]。本论文以牛膝为原料,采用单因素实验和响应面分析法,优化了超声提取齐墩果酸的方法,具有一定的研究和实用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

怀牛膝 购自同仁堂药店;齐墩果酸标准品(纯度≥98%) 购于中国食品药品检定研究院;无水乙醇、香草醛、冰醋酸、乙酸乙酯等化学试剂均为分析纯 北京化学试剂公司。

T6紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；H/T16MM台式高速离心机 湖南赫西仪器装备有限公司;TGCX2-2B超声循环提取机 北京弘祥隆生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准曲线的制作 精密称取齐墩果酸标准品2mg,以无水乙醇为溶剂,定容于10mL容量瓶中,即得0.2mg/mL的齐墩果酸标准溶液。分别吸取齐墩果酸标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL(即分别含齐墩果酸0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14mg),置于具塞试管中,60℃加热挥去溶剂后,加5%香草醛-冰醋酸0.2mL,高氯酸0.8mL。然后在70℃水浴中加热15min,取出冷却至室温。再加乙酸乙酯定容至5mL,摇匀,在最大波长560nm处测定吸光度,同时以未加对照品的试剂空白作参比。以吸光度为纵坐标,齐墩果酸含量为横坐标,得到的标准曲线方程为:A560nm=11.315C+0.0523,R2=0.9965。

1.2.2 牛膝齐墩果酸的提取 将牛膝清洗干净,于70℃干燥4h,粉碎过40目筛,得牛膝粉末。称取1g加入适量乙醇,在设定温度下超声波处理一定时间,处理后离心30min,浸提1h后抽滤,测定滤液中的齐墩果酸含量。

齐墩果酸提取含量(mg/g)=(CV)/M,其中,C:根据回归方程计算齐墩果酸浓度(mg/mL);V:齐墩果酸提取液定容体积(mL);M:原料质量(g)。

1.2.3 齐墩果酸提取的单因素实验方法 乙醇浓度对齐墩果酸提取含量的影响:在超声功率500W,在料液比为1∶15,超声时间30min的条件下,分别选取乙醇浓度50%、60%、70%、80%、90%进行超声提取。料液比对齐墩果酸提取含量的影响:在超声功率500W,乙醇浓度为70%,超声时间30min的条件下,分别选取料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(w/v)进行超声提取。提取时间对齐墩果酸提取含量的影响:在超声功率500W,料液比1∶25,乙醇浓度70%下,分别选取超声时间10、20、30、40、50min进行超声提取。

1.2.4 齐墩果酸提取的响应面分析方法 在单因素实验的基础之上,应用响应面法中的Box-Behnken设计对提取乙醇浓度、料液比、超声时间3个因素进行优化。实验设计借助Design Expert 软件,因素的水平及编码如表1。

表1 中心组合设计实验因素水平及编码Table 1 Central Composite design experimental factor and coding

1.3 数据统计分析

所有实验重复三次,取平均值,显著性分析采用SPSS17.0软件处理。

2 结果与讨论

2.1 乙醇浓度对齐墩果酸提取含量的影响

乙醇浓度对齐墩果酸提取含量的影响如图1所示。随着乙醇浓度的升高,齐墩果酸的提取含量先升高后下降,这可能与齐墩果酸的极性有关,当乙醇溶液体积分数为70%时,齐墩果酸的极性与之最为接近,所以提取含量最高,达到8.89mg/g,因此选70%乙醇浓度较为合适。

图1 乙醇浓度对齐墩果酸提取含量的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of oleanolic acid

2.2 料液比对齐墩果酸提取含量的影响

料液比对齐墩果酸提取含量的影响如图2所示。随着料液比增加,溶剂用量增加使得齐墩果酸的扩散浓度差增大,提高了扩散速度,提取含量迅速增加,当料液比为1∶25(w/v)时,提取含量达到10.62mg/g。当料液比为1∶30(w/v)时,齐墩果酸提取含量有所下降,可能是实验误差所致。理论上,随着料液比越大,提取出的齐墩果酸应越多,但在整个提取过程中也会有部分损失而带来误差。

图2 料液比对齐墩果酸提取含量的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of oleanolic acid

2.3 超声时间对齐墩果酸提取含量的影响

当超声功率为500W时,超声时间对齐墩果酸提取含量的影响如图3所示。超声波时间太短对细胞破损造成的影响较小,仍有较多齐墩果酸在细胞内没有被提取出来;超声波时间太长,超声波可能对齐墩果酸造成影响,使齐墩果酸提取含量减少。合适的超声时间是20min,提取含量是10.32mg/g。

图3 提取时间对齐墩果酸提取含量的影响Fig.3 Effect of ultrasonic time on the extraction yield of oleanolic acid

2.4 齐墩果酸提取响应面优化实验

2.4.1 实验数据及模型的建立 依据上述单因素实验结果,以乙醇浓度A、提取时间B和料液比C为变量,以齐墩果酸Y为响应值设计响应面实验方案及结果见表2。

经Design Expert 7.0 软件进行数据分析,经过响应面的回归分析得到如下回归方程为Y=11.48+0.27A+0.21B+0.98C+0.055AB+0.040AC+0.013BC-1.55A2-1.68B2-1.19C2

表3为回归方程方差分析表,实验所选用模型显著(p<0.0001),拟合度好。方程的回归系数显著性检验表明,因素A和C对齐墩果酸含量的线性效应显著,二次项影响显著,其余因素影响不显著,具体见表4。

表2 响应面分析实验结果Table 2 Design and result of response surface methodology test

表3 回归方程方差分析表Table 3 Regression equation analysis of variance table

2.4.2 响应面图分析结果 将一个因素同定在零水平,利用Design Expert 7.0软件即可作出三种因素交互作用的响应曲面图。响应面分析中,回归方程中各变量对响应值的影响显著性由F检验判定,理论上p值越小,则对应的响应值越显著。当p<0.0001时,说明其所对应的条件对响应值的作用是极显著的,p<0.05时则认为其影响显著。逐项显著性检验结果表明,一个一次项(C-C),三个二次项(A2,B2,C2)是对牛膝齐墩果酸提取含量影响显著的项(p<0.0001)。综合来看,二次项对响应值的影响显著,说明各实验因素对响应值的影响不是简单的线性关系。图4A、图4B显示了固定提取时间和料液比后,乙醇浓度对齐墩果酸提取含量的影响,由于齐墩果酸易溶于有机溶剂,随着乙醇浓度的升高,齐墩果酸的提取含量先升高后下降,这可能与齐墩果酸的极性有关。当乙醇溶液体积分数为70%时,齐墩果酸的极性与之最为接近,所以提取含量最高。图4A、图4C显示固定乙醇浓度和料液比后,提取时间对齐墩果酸提取含量的影响。随着提取时间的增加,牛膝齐墩果酸提取含量先增加后减小。这说明充足的提取时间对于破坏细胞结构、扰动细胞表面、提高齐墩果酸释放率是必须的。但是继续增加时间会有其他杂质溶出,引起物质纯度降低。图4B、图4C显示固定乙醇浓度和时间后,料液比对齐墩果酸的提取含量的影响,在1∶25时提取含量最高,随后提取含量减小,尽管料液比增加有利于齐墩果酸溶出,但在整个提取过程中总会有原料和成品的损失,料液比越大,损失越大,所以齐墩果酸提取含量在料液比1∶30(w/v)时有下降趋势。

表4 回归方程系数显著性检验Table 4 Regression equation significance test

图4 齐墩果酸提取得率影响的响应面交互作用图Fig.4 Response surface plot for the effects on the extraction yield of oleanolic acid

2.4.3 最佳工艺及验证实验 根据所得到的模型,得到最佳工艺条件是乙醇浓度70.93%,提取时间20.66 min,料液比1∶20.08,在此条件下齐墩果酸的最大提取含量是11.70mg/g。为了检验预测结果是否与实际值相似,根据上述实验结果进行了验证实验,考虑到实验方便可行,将较佳工艺条件调整为乙醇浓度70%,提取时间20min,料液比1∶20(w/v)。在此条件下进行3次平行实验,齐墩果酸的提取率为(11.14±0.14)mg/g,与响应面预测值11.70mg/g相比,相对误差在5%以内。与模型的预测值基本一致,由此可以得出该模型可以很好的模拟齐墩果酸的提取条件。

3 结论

通过单因素实验和Design Expert 7.0对牛膝中齐墩果酸的提取条件进行了优化,较优提取条件为乙醇浓度70%、提取时间20min、料液比1∶20。验证实验平均值为11.14mg/g,与预测值11.70mg/g相接近,说明响应面模型可以很好的模拟齐墩果酸的提取条件。本研究结果为工业化生产提供了相应的基础数据,下一步研究将进行放大提取。

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Optimization of ultrasonic assisted extraction of oleanolic acid from achyranthes by response surface methodology

ZHAO Ming-xia1,2,OUYANG Jie1,2,*

(1. Department of Food Science and Engineering,College of Biological Science and Technology,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China;2. Beijing Key Laboratory of Forest Food Processing and Safety,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China)

Oleanolic acid was extracted from achyranthes root by ultrasonic assisted extraction. The effects of ethanol concentration,solid-liquid ratio,and extraction time on the extraction yield of oleanolic acid were investigated. The extraction technology was optimized by response surface methodology. The results showed that the optimal extraction conditions of oleanolic acid were as follows:ethanol concentration was 70%,extraction time was 20min,and solid-liquid ratio was 1∶20. Under above conditions,the extraction yield of oleanolic acid reached 11.14mg/g.

Achyranthes;oleanolic acid;ultrasound assisted;extraction

2014-04-15

赵明霞(1988-)，女，硕士研究生，研究方向：食品加工与安全。

*通讯作者:欧阳杰(1971-)，男，博士，副教授，研究方向：食品生物技术。

第44批回国留学人员科研启动基金。

TS201.2

B

1002-0306(2015)01-0272-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.048