火棘果不同极性部位提取物体外抗氧化研究

翁文江,高 雪,*

(1.重庆工商大学催化与功能有机分子重庆市重点实验室,重庆 400067;2.重庆工商大学天然药物研究重庆高校市级重点实验室,重庆 400067；3.重庆工商大学环境与生物工程学院，重庆 400067)

火棘果不同极性部位提取物体外抗氧化研究

翁文江1,2,3,高 雪1,2,3,*

(1.重庆工商大学催化与功能有机分子重庆市重点实验室,重庆 400067;2.重庆工商大学天然药物研究重庆高校市级重点实验室,重庆 400067；3.重庆工商大学环境与生物工程学院，重庆 400067)

目的:系统地评价火棘果粗分体系抗氧化活性,同时探究抗氧化能力与总多酚含量之间的关系。方法:用75%乙醇冷浸提取火棘果,分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水分为四个不同极性部位,然后测定了各部位萃取物对DPPH自由基、ABTS+自由基的清除能力,并且测定了总还原力、FRAP值和总多酚含量,同时考察总酚含量与抗氧化活性的关系。结果:火棘果提取物的不同极性部位均有抗氧化活性,其中水、乙酸乙酯和正丁醇部位提取物表现出较好的抗氧化活性,石油醚部位的抗氧化活性最弱;各部位提取物的抗氧化活性与总多酚含量呈现较好的相关关系。其中,水部位提取物对DPPH和ABTS+自由基清除率最高,IC50值分别为(0.76±0.03)mg/mL和(1.71±0.10)mg/mL;乙酸乙酯部位FRAP值最大,为(382.20±4.72)μmolFe2+/g干样;正丁醇部位总酚含量最高,为(2763±3.91)mgGAE/100g干样。

火棘果,抗氧化活性,总多酚含量

火棘(Pyracanthafortuneana)为蔷薇科苹果亚科(Maloideae)火棘属(Pyracantha)多年生常绿灌木[1]。火棘的药用曾记载于《滇南本草》和《本草纲目》,近年来的研究表明火棘果实具有潜在的食用和药用开发价值。据报道火棘果具有无毒、清除自由基、增强免疫力、降低血脂和促进代谢等作用[2],有关火棘果清除自由基的研究多集中于总提物、火棘多酚和火棘多糖等成分[2-4]。为了系统地评价火棘果总提物不同极性部位的抗氧化活性,同时探究抗氧化能力与其总多酚含量之间的关系,本文检测了火棘果不同极性部位提取物清除DPPH·、ABTS+·的活性,总还原能力、FRAP法抗氧化能力以及总酚含量,获取了火棘果不同极性部位提取物体外抗氧化基础数据,分析了四种抗氧化检测方法的相关关系以及抗氧化活性与总多酚含量的相关关系,可望为火棘果开发植物性天然无毒抗氧化剂和功能性保健食品提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

火棘果 采自重庆城口县;1,1-二苯基苦基苯阱(DPPH) 上海晶纯试剂有限公司;抗坏血酸(分析纯) 阿拉丁公司;ABTS[2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐] 上海山浦化工有限公司;TPTZ(2,4,6-三吡啶基均三嗪) 东京化成工业株式会社;福林酚 天津光复精细化工研究所;无水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚、过硫酸钾、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、硫酸亚铁等 国产分析纯。

Re-2000型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;明澈-D24UV实验室超纯水机 Millipore公司;Acculab电子天平 德国赛多利科学仪器有限公司;Infinite M200型酶标仪 Tecan公司;Biofuge Stratos台式高速冷冻离心机 Thermo Fisher公司;Gilson P型微量移液器 四川吉尔森仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 火棘果不同溶剂提取工艺 将新鲜摘取的干净野生火棘果放入60℃烘箱中烘干,粉碎,用75%乙醇冷浸提取3次,每次7d。浸出液经过滤、减压浓缩、干燥得到火棘果总提物。将总提取物溶于温水中,依次用石油醚、乙酸乙酯及正丁醇萃取2～3次,合并萃取液,最后得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位的萃取物。将各组萃取物减压浓缩后,真空冷冻干燥至恒重,密封置于冰箱冷藏备用。

1.2.2 各相萃取物清除DPPH自由基活力的检测 采用Blois等[5]的方法并加以改进。用无水乙醇将DPPH配制成1mmol/L的溶液。在1.5mL tuber管中分别准确加入200μL样品待测溶液和200μL DPPH溶液,混和均匀后,然后暗处室温下放置30min,最后在波长517nm处测定吸光值,平行测定3次,用抗坏血酸(VC)为阳性对照。按下列式子计算各待测样品对DPPH自由基的清除率:

清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100

式中:Ai为200μL DPPH试剂与200μL样品溶液的混合液吸光度;Aj为200μL样品溶液与200μL无水乙醇混合液的吸光度;Ac为200μL无水乙醇与200μL DPPH溶液的混合液吸光度。

1.2.3 各相萃取物清除ABTS自由基活力的检测 采用Carrasco-Castilla等[6]的方法并加以调整。取38.4mg ABTS溶解于10mL水中形成7mmol/L的溶液,然后加入6.6mg过硫酸钾固体,溶液颜色瞬间变成蓝绿色,旋涡均匀后形成的混合溶液中过硫酸钾的最终浓度为2.45mmol/L,迅速将上述混合溶液置于室温黑暗条件下12～16h。测试样品之前,将上述溶液用pH7.4的磷酸缓冲液稀释到在734nm处的吸光度为0.70±0.002,得到待测ABTS+·溶液。将990μL ABTS+·液中加入10μL的样品溶液,旋涡均匀之后孵育5min检测吸光值。用抗坏血酸(VC)为阳性对照,ABTS+自由基清除百分比计算:

清除率(%)=[1-(A-B)/C]×100

其中,A:990μLABTS+10μL样品/对照品混合液的吸光度;B:990μL磷酸缓冲液+10μL样品/对照品混合液的吸光度;C:990μL ABTS+10μL去离子水混合液的吸光度。

1.2.4 各萃取部位总还原力的测定 采用Liu S和马合木提·买买提明[7-8]的方法并稍加调整。取火棘提取物溶液100μL与250μL 0.2mol/L pH6.6的磷酸纳缓冲液和250μL 1%的K3Fe(CN)6混合均匀,混合溶液在50℃水浴中孵育30min。将10%的三氯乙酸250μL加入混合溶液后旋涡均匀,室温下3000r/min离心20min。最后,取250μL上清液、250μL蒸馏水和0.1%的FeCl3溶液50μL混合均匀,在700nm处检测吸光度。用抗坏血酸(VC)为阳性对照。

1.2.5 各萃取部位FRAP值检测 参考Benzie等[9]的方法并加以改进。将300mmol/L醋酸盐缓冲液(pH3.6)、20mmol/L FeCl3溶液、40mmol/L HCl 配制的10mmol/L TPTZ溶液按照体积比10∶1∶1混合均匀,配制成FRAP试剂,备用。取100μL样品或对照物和1mL 预热至37℃的FRAP混合、旋涡均匀,5min后593nm处检测吸光值,去离子水作为参照液。根据以上相同步骤,用FeSO4标准溶液做出标准曲线。通过吸光值求得标准曲线上相应FeSO4的浓度(μmolFe2+/L),定义FRAP值为样品FRAP值等值于每克干样品中Fe2+微摩尔数(μmolFe2+/g干样品)。

1.2.6 总多酚含量(TPC)测定 根据福林酚比色法原理,采用Kim等[10]的方法并加以改进。取50μL一定浓度的样品液与25μL福林酚试剂混合均匀,孵育3min,然后加入2%(w/v)的Na2CO3溶液1mL,旋涡均匀,常温暗室放置60min后于756nm读吸光值。根据以上相同步骤,用没食子酸标准溶液做出测总酚的标准曲线,样品总酚含量等值于每100g干样品中五倍子酸的毫克数(mgGAE/100g干样品)。

1.3 数据处理与相关性分析

计算结果以均值±标准差(x±s)表示,绘图采用Origin7.1软件,相关性分析由SPSSv19.0软件分析。抗氧化活性的相关性分析以样品浓度为1.25mg/mL的数据带入。

2 结果与分析

2.1 清除DPPH自由基能力

DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基,其乙醇溶液呈深紫色,具有单一电子,在波长为517nm下具有最大光吸收,有自由基清除剂存在时,DPPH的单电子被捕捉而使其颜色变浅[11]。根据表1可知,火棘果提取物清除DPPH自由基的能力:在较低浓度范围下,水相和乙酸乙酯部位萃取物清除DPPH自由基的能力相差不大,清除效果均较好,正丁醇部位次之,效果最差的是石油醚部位提取物。

表1 不同溶剂提取物体外抗氧化实验清除自由基IC50值、FRAP值和总酚含量Table 1 The results of antioxidant activity in vitro(IC50,FRAP)and TPC of different solvent extracts

注:同一行标记字母不同,表示显著差异,p<0.05。

水部位提取物和乙酸乙酯部位提取物清除自由基的能力强,IC50均小于1mg/mL,分别为(0.76±0.03)mg/mL和(0.80±0.01)mg/mL。当浓度达到2.5mg/mL时,水部位提取物对DPPH自由基清除率达到93.45%,乙酸乙酯部位提取物对DPPH自由基清除率高达94.79%。可能的原因是清除DPPH自由基活性成分主要被富集在水部位和乙酸乙酯部位。

图1 不同溶剂提取物对DPPH自由基的清除作用Fig.1 DPPH· scavenging rate of different solvent extracts

2.2 清除ABTS自由基能力

ABTS在适当的氧化剂作用下氧化成绿色的ABTS+,在抗氧化物存在时ABTS+的产物会被抑制[12],已广泛应用于天然药物、海洋生物、果蔬类等的抗氧化能力的评价。火棘果各部位提取物表现出的ABTS+自由基清除活力对浓度呈正相关。其中,水部位提取物清除ABTS+自由基的IC50值为(1.71±0.10)mg/mL,正丁醇部位和乙酸乙酯部位提取物分别为(2.11±0.24)mg/mL和(3.43±0.12)mg/mL,石油醚部位最弱,IC50值大于5mg/mL,效果都要差于阳性对照VC。当浓度达到5mg/mL时,乙酸乙酯部位提取物对ABTS+自由基清除率为78.50%,水部位提取物清除率则为86.34%。由表1和图2可以得出,水相部位提取物对ABTS+自由基清除能力最强,石油醚部位最弱。出现这种结果的原因可能是火棘果中清除ABTS+自由基的活性成分极性大小较大,主要富集于水部位和正丁醇部位。李伟等[4]研究发现由于物质结构的差异,同一种多酚类物质对不同自由基清除率有差异。因而推测引起火棘果不同极性部位对两种自由基清除作用的差异可能与火棘果活性成分结构的不同以及自由基的结构性质有关。

图2 不同溶剂提取物对ABTS自由基的清除作用Fig.2 ABTS+· scavenging rate of different solvent extracts

2.3 总还原力测定结果

在还原能力测定实验中,样品中的抗氧化剂的存在将导致铁氰化钾中Fe3+得到一个电子被还原成Fe2+,Fe2+进一步生成在700nm处有最大吸光值的普鲁士蓝,因此测定700nm处吸光值可以反应抗氧化剂还原能力的大小[13]。一般地,样品在一定浓度范围内,还原力强弱与抗氧化性溶液浓度呈正相关性。由图3可知,VC在较低浓度就表现出非常好的总还原能力,火棘果各部位总还原能力最强的是水部位萃取物,乙酸乙酯和正丁醇部位部位萃取物次之,石油醚部位萃取物的总还原能力最弱,均弱于阳性对照VC。样品浓度低于0.625mg/mL时,还原力相差不大;样品浓度高于1.25mg/mL时,总还原力值开始出现差异,但乙酸乙酯部位和水部位依然差异不明显。

图3 不同溶剂提取物的总还原能力Fig.3 Reduction abilities of different solvent extracts

2.4 FRAP值测定结果

Fe3+吡啶三吖嗪可被样品中还原物质还原为二价铁形式,呈现出蓝色,并于593nm处具有最大光吸收,根据吸光度大小计算样品抗氧化活性的强弱,FRAP值越大,抗氧化活性越强。通过线性拟合,FeSO4标准曲线方程式为:Y=1.1408X-0.004,R2=0.9999,p<0.0001。各相提取物中抗氧化成分将Fe3+-TPTZ还原成Fe2+-TPTZ复合物,吸光度明显随提取物浓度的增加而增加。由表1可以得知,乙酸乙酯部位和水部位提取物的FRAP值均较大,铁还原能力强,石油醚部位提取物的FRAP值相对较低,铁还原能力弱。研究发现中药材山楂和山茱萸提取物的FRAP值分别为为332.00±3.23、311.10±17.77[14],效果均要弱于火棘果不同极性部位提取物。说明火棘果有较好的铁离子还原能力。

2.5 总多酚含量测定结果

植物多酚是植物体内最普遍存在的次生代谢物质,是植物次生代谢物质唯一的分子水平上的防御物质,植物多酚的研究对于揭示植物的化学防御和微生物、植食动物的协同进化机制具有重要意义[15]。没食子酸标准曲线方程:Y=0.0182+2.9582X,R2=0.9995,p<0.0001。火棘果提取物的总酚含量见表1。从表1中正丁醇部位、乙酸乙酯部位、水部位萃取物总酚含量均较多,石油醚部位含量最少。其中正丁醇部位总酚含量最大((2763±3.91)mgGAE/100g干样品),是总酚含量最小的石油醚部位((1987±3.28)mgGAE/100g干样品)的1.4倍。研究结果表明,火棘果中总酚类物质的极性较大,大部分富集于正丁醇部位和乙酸乙酯部位。

2.6 抗氧化活性方法间相关性分析

运用SPSS软件进行分析,进行了四种抗氧化检测方法的相关性分析,结果见表2,DPPH·清除法、FRAP法和总还原力的相关性好,相关系数均在0.855以上,其中,FRAP法与DPPH·清除法和总还原力法的相关性最好,分别为0.935、0.941。总体看来,火棘果提取物对DPPH·、ABTS+·、PRAP和总还原力体系抗氧化活性基本一致,但又略有差异。出现差异的原因可能是由于粗提物的活性成分比较复杂,且不同抗氧化检测方法的机理不同[11-13]所致。

表2 四种检测方法相关性分析Table 2 Correlation analysis of four methods and TPC

注:*表示在0.05水平上显著相关,**表示在0.01水平上显著相关。表3同。

2.7 总多酚含量与抗氧化活性相关性分析

根据表3,DPPH·清除法、ABTS+·清除法、FRAP法和总还原力法测定的抗氧化活性与总多酚含量之间均存在相关关系,其中,FRAP法、总还原力法测定的抗氧化活性与总多酚含量的相关系数分别为0.847和0.944(p<0.01),而DPPH法、ABTS法测定结果与总多酚含量的相关性相对较弱(p<0.05),相关系数均小于0.75。综上所述,总多酚含量与四种抗氧化检测模型存在较好的相关关系,说明各部位提取物中的抗氧化活性物质主要是多酚类物质。多酚类物质含有的酚羟基具有提供质子氢的能力,能够淬灭和还原自由基,终止自由基链式反应,从而起到抗氧化的作用。研究发现蓝莓叶提取物总酚含量与抗氧化活性相关性及显著[16],火棘果提取物的研究结果与之相似。

表3 火棘果抗氧化活性与总多酚含量的相关关系Table 3 Correlation analysis of the antioxidant activity and TPC

3 结论

由于不同抗氧化检测方法的反应机理不同,为获得可靠的结论,本实验运用DPPH·清除法、ABTS+·清除法、FRAP法和总还原力法对火棘果不同极性溶剂提取物的抗氧化能力进行了系统的评价。火棘果四种不同极性部位提取物表现出对DPPH·、ABTS+·、FRAP和总还原力良好的抗氧化活性,且相关性基本一致,但略有差异。火棘果水部位对DPPH·、ABTS+·的清除活性最强,IC50值分别为0.76mg/mL和1.71mg/mL;乙酸乙酯部位FRAP值最高,但与水部位相差不大。

大量的实验研究表明,酚类化合物是天然植物提取物中具有抗氧化活性的主要物质基础[7-8]。本实验对总多酚与抗氧化活性的相关性分析结果表明,火棘果不同极性部位提取物的抗氧化能力与总多酚含量存在较好的相关关系(p<0.05),也提示火棘果中除多酚类化合物外,还存在其他具有抗氧化活性的物质。

本研究综合评价了火棘果总提物不同极性部位的体外抗氧化活性,同时探究了抗氧化能力与总多酚含量之间的关系,可望为火棘果的进一步开发和利用提供科学的实验数据和理论依据,为深入挖掘火棘果在食品、医学等领域的应用提供参考价值。

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Study on antioxidant activityinvitroabout different solvent extracts of fruits ofPyracanthafortuneana

WENG Wen-jiang1,2,3,GAO Xue1,2,3,*

(1. Chongqing Key Lab of Catalysis & Functional Organic Molecules,Chongqing Teachnology and Business University，Chongqing 400067,China;2. Chongqing Key Laboratory of Natural Medicine Research,Chongqing Technology and Business University,Chongqing 400067,China;3.School of Environment and Biological Engineering,Chongqing Technology and Business University,Chongqing 400067,China)

Objective:To evaluatethe antioxidant activity of fruits ofPyracanthafortuneanacomprehensively,and explore the relationship between the antioxidant activity and total polyphenol content. Methods:Extracting fruits ofPyracanthafortuneanawith 75% ethanol,petroleum ether,ethyl acetate,n-butanol and water extracts were obtained. All extracts were evaluated by DPPH free radical and ABTS+free radical scavenging activity,the total reducing power,the fluorescence recovery after photobleaching experiment(FRAP)and the total polyphenol content. Conclusions:All extracts of fruits ofPyracanthafortuneanaexhibited antioxidant activities. The water,n-butanol and ethyl acetate extracts both exhibited preferable antioxidant activity,the petroleum ether extract had the weakest antioxidant activity. Antioxidant activities of both extracts were generally positively related with the total polyphenol content. The water extract showed the highest radical scavenging rate on DPPH and ABTS+,the IC50were (0.76±0.03)mg/mL and (1.71±0.10)mg/mL. The ethyl acetate extract showed the highest value of FRAP with(382.20±4.72)μmolFe2+/g. The highest content of total phenolics was from n-butanol extract with (2763±3.91)mg GAE/100g.

fruits ofPyracanthafortuneana;antioxidant activities;total polyphenol content

2014-03-05

翁文江(1990-),男，在读硕士研究生，研究方向：环境生物质资源化研究。

*通讯作者:高雪(1980-)，女，博士，副研究员，研究方向：天然产物化学的研究。

重庆市科技创新团队项目(KJTD201020)；国家自然科学基金资助(21402017)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)01-0077-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.008