糖尿病大鼠肾脏XBP1的表达及普罗布考的干预研究

汪玉芹，刘丽秋，张 伟，王淑娟

（1.青岛大学医疗集团莒县人民医院，山东莒县276500；2.青岛大学附属医院）

糖尿病大鼠肾脏XBP1的表达及普罗布考的干预研究

汪玉芹1，刘丽秋2＊，张 伟2，王淑娟2

（1.青岛大学医疗集团莒县人民医院，山东莒县276500；2.青岛大学附属医院）

目的通过观察糖尿病大鼠肾脏中X盒结合蛋白1（XBP1）的表达，评价肾脏的内质网应激水平，并通过观察普罗布考对XBP1表达的影响，探讨其肾脏保护作用。方法80只大鼠随机分为健康对照组（C组n＝25）及造模组（n＝55），造模组给予链脲佐菌素（STZ）60mg／kg一次性腹腔注射构建1型糖尿病大鼠模型，将造模成功的糖尿病大鼠随机分为糖尿病组（D组n＝28），普罗布考组（P组n＝27）。P组给予普罗布考110mg／kg.d灌胃，D组及C组给予同体积蒸馏水灌胃。分别检测4周，8周及12周24h尿蛋白，血清胆固醇、甘油三脂、尿素氮及肌酐。光镜下观察肾脏病理变化，免疫组化观察肾组织XBP1的表达情况，western－blot测定XBP1的表达情况。结果C组24h尿蛋白、血清尿素氮、肌酐、甘油三酯及胆固醇4周，8周及12周均处于正常范围，D组以上指标在4周、8周及12周逐渐升高，明显高于同时间的C组，差别有统计学意义（P＜0.05），P组以上指标亦逐渐升高，但明显低于同时间的D组，差别有统计学意义（P＜0.05）；C组大鼠肾脏在4周、8周及12周均显示正常肾脏结构，D组大鼠表现出明显的节段性硬化等糖尿病肾病的病理改变，P组大鼠病理改变较D组明显减轻；免疫组化显示D组大鼠肾脏中XBP1的表达在4周、8周及12周逐渐升高，明显高于同时间C组，P组大鼠肾脏中XBP1的表达较D组明显减少，免疫组化积分均有统计学差异（P＜0.05）；Westernblot结果与免疫组化相符。结论糖尿病大鼠肾脏中XBP1的表达增多，说明糖尿病大鼠肾脏中内质网应激水平升高，普罗布考可以通过降低内质网应激，下调XBP1的表达起到肾脏保护作用。

糖尿病肾病；内质网应激XBP1普罗布考

（Chin J Lab Diagn，2015，19：0190）

近年来大量研究发现氧化应激在糖尿病肾病的发生及进展中起着重要作用。氧化应激的主要机制为自由基损伤及钙超载，内质网在调节细胞内钙离子的平衡中起重要作用。X盒结合蛋白1（XBP1）是内质网应激的主要活化转录因子，其表达量可反映细胞内内质网应激的水平［1］。本实验通过观察糖尿病大鼠肾脏中XBP1的表达评估内质网应激水平，进一步研究糖尿病肾病的发病机制，并通过观察普罗布考对XBP1表达的影响，探讨其肾脏保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂

6－8周龄清洁级健康雄性wistar大鼠，体质量为180－200g，购自山东鲁抗实验动物中心，兔抗大鼠XBP1抗体（美国abcam公司），STZ（美国sigma公司），血糖试纸（美国强生），普罗布考（齐鲁制药有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 糖尿病大鼠模型的建立与分组 80只6－8周龄体质量为180－200g的雄性wistar清洁级大鼠，适应性喂养1周，随机分为健康对照组（C组n＝25）及造模组（n＝55），STZ按照说明书配置，造模组禁食24h后一次性腹腔注射STZ60mg／kg构建糖尿病大鼠模型。腹腔注射STZ72h后鼠尾静脉测随机血糖，血糖＞16.7mmol／L并能维持1周者为造模成功，造模成功的糖尿病大鼠随机分为糖尿病组（D组n＝28））及普罗布考干预治疗组（P组n＝27）。

1.2.2 治疗及标本收集方法 P组大鼠给予普罗布考110mg／kg.d灌胃，D组和C组给予等体积的蒸馏水灌胃，分别于4周，8周，12周处死8只大鼠，处死前1天放入代谢笼留取24h尿，记录24h尿量，－30℃冰箱冻存；水合氯醛3ml／kg腹腔注射麻醉后，内眦静脉取血，3 500r／min离心10min，留取血清，－80℃冰箱冻存；并于麻醉后开腹取双肾，去除肾脏表面包膜，并将肾脏纵向剖开，取1／2左侧肾脏固定于10%中性甲醛溶液中，其余肾组织放于液氮中冻存。

1.2.3 血、尿相关指标检测 24h尿蛋白定量、甘油三酯、胆固醇、尿素氮及肌酐采用美国Beckcoulter DXC800全自动生化分析仪进行检测。

1.2.4 肾脏病理 肾组织固定、切片（厚度2μm），HE染色，光镜下观察肾脏组织形态学及结构的变化。

1.2.5 免疫组化测定XBP1的表达 二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，3%过氧化氢孵育10min（室温），PBS浸洗5min，滴加抗原修复液室温10min，PBS清洗3次，滴加封闭用山羊血清，室温孵育10min，加入兔抗大鼠4－HNE抗体（1∶1 000），4摄氏度过夜，复温10min，PBS冲洗2min×3次。滴加抗兔二抗，37℃孵育20min，PBS漂洗5min×3次。DAB显色，苏木素复染后封片观察，应用PBS代替一抗作阴性对照。以免疫组化染色积分反映4－HNE的表达水平［2］。

1.2.6 Western－blot测定XBP1的表达 取液氮保存后的肾组织，充分研磨、裂解、离心后，取上清液测定蛋白浓度，100℃加热5min，取40μg／lane上样后电泳，样本用15%Tris－Glycine胶电泳分离蛋白后，电泳转到PVDF膜上，5%的脱脂牛奶封闭2 h，以l×TBST洗涤后，与兔抗大鼠XBP1抗体（1∶ 500）4℃过夜，然后加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶2 000）室温孵育1h，应用ECL检测样本的免疫活性，暗室曝光，X胶片显影，应用美国UVP分析仪器扫描胶片，得出灰度值，用同样方法标记鼠单克隆抗体β－actin作为胞质蛋白内参对照。

1.2.7 统计学处理 检测数据以均数±标准差表示，计量资料分析采用单因素方差分析，组间两两比较应用Bonferroni检验，免疫组化染色积分采用非参数统计方法，显著性水平设为P＜0.05，所有资料应用SPSS17.0统计软件进行数据分析。

2 结果

2.1 生化指标C组尿素氮、肌酐、甘油三酯及胆固醇在4周、8周及12周均处于正常范围，D组以上指标在4周、8周及12周逐渐升高，并明显高于同时间的C组，差别有统计学意义（P＜0.05），P组以上指标亦逐渐升高，但明显低于同时间的D组，差别有统计学意义（P＜0.05）（见表1）

表1 各组大鼠不同时间生化指标比较（均数±标准差）

2.2 肾脏病理D组大鼠肾脏在8周时可见肾小球体积增大，系膜区增宽，系膜基质增多，并可见节段性硬化，12周时以上病理改变更为明显，节段性硬化进一步加重，并出现肾小球分叶，肾小囊腔不规则狭窄，并与肾小球粘连。P组大鼠肾脏以上病理改变较同时间的D组明显减轻。C组表现为大致正常的肾脏结构（图1）。

图1 各组大鼠肾脏病理改变（HE染色×200）

2.3 免疫组化D组大鼠肾脏中XBP1主要表达在肾小管，并在4周、8周及12周表达逐渐升高，其免疫组化染色积分明显高于同时间C组，差别有统计学意义（P＜0.05），P组大鼠肾脏XBP1的表达亦逐渐升高，但其免疫组化染色积分明显低于同时间D组，差别有统计学意义（P＜0.05）（图2）。

图2 各组大鼠肾组织4－HNE免疫组化染色（×400）及柱形图

2.4 Western－blot结果D组大鼠肾脏XBP1蛋白的表达逐渐升高，明显高于同时间C组，差别有统计学意义，P组大鼠肾脏XBP1的表达在4周、8周、12周逐渐升高，但明显低于同时间D组，差别有统计学意义（P＜0.05）（图3）。

图3 各组大鼠肾组织XBP1免疫印迹及相对表达量柱形图

3 讨论

内质网应激是由于未折叠的或错误折叠的蛋白质在内质网中蓄积所引起的，这一过程成为未折叠蛋白反应（UPR）。UPR可以触发内质网与高尔基体之间的信号转导，从而抑制未折叠蛋白的合成，在一定程度上可以起到细胞保护作用，但过强的ESR可以诱导细胞的凋亡［3，4］。目前研究发现UPR主要由3中蛋白介导：I型内质网跨膜蛋白激酶（IRE－1）、转录激活因子6（ATF6）及双联RNA依赖性蛋白激酶样内质网激酶（PERK）。未发生ESR的情况下，上述3种蛋白以无活性的形式与葡萄糖调节蛋白78（GPR78）结合。在ESR情况下，未折叠或错误折叠的蛋白质与GRP78结合，激活IRE－1、ATF6及PERK，从而诱导UPR的过程［5］。

X盒结合蛋白1（XBP1）是ESR的活化转录因子，XBP1mRNA含有26个不典型的内含子，UPR可以激活IRE1，后者可以裂解XBP1mRNA，诱导XBP1的表达上调［6］。XBP1可以结合内质网应激相关元件（ERSE）及未折叠蛋白反应元件（UPRE），上调内质网分子伴侣相关基因的表达，以帮助修饰、转运或降解内质网中堆积的未折叠的蛋白质，从而维持细胞内的稳态。XBP1的水平可以反应内质网应激的水平［6］。此外，研究表明XBP1还可以维持细胞内过氧化氢酶及超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化因子的水平；当ESR过强时XBP1还可以诱导caspase及CHOP等凋亡相关基因的表达，诱导细胞的凋亡［7］。目前研究发现在，缺血再灌注的脑组织，缺血再灌注的肝脏中及肝癌患者的肝细胞中XBP1的表达明显升高［6，8，9］。目前研究表明，内质网应激也参与了糖尿病肾病的发生及进展，但目前尚未见XBP1在糖尿病肾脏中的表达的相关报道。

本实验观察到STZ诱导的糖尿病大鼠在8周时出现典型的糖尿病肾病的病理改变，包括系膜基质的增多，并可见节段性的硬化，肾小囊出现不规则的狭窄，肾小球在12周时可见分叶，且硬化更加明显。XBP1在糖尿病大鼠的肾脏中的表达明显升高，12周时表达量最高。其表达升高的可能机制如下：大量研究已经证实糖尿病肾脏的氧化应激水平明显升高，活性氧产物（ROS）及脂质过氧化产物如4－HNE可以导致蛋白质结构的改变［10］，使未折叠或错误折叠的蛋白质在内质网中堆积，并与GRP78结合，激活IRE1，后者可诱导XBP1的表达增多。

本实验还观察到应用普罗布考干预治疗的糖尿病大鼠肾脏中XBP1的表达明显下降。目前研究发现普罗布考具有强大的抗氧化作用［11］，考虑其下调XBP1的机制为：普罗布考是含有酚羟基的断链抗氧化剂，其强大的抗氧化能力可以消耗体内的ROS，并可以降低脂质过氧化的水平，使蛋白质的折叠与转运免受氧化应激产物的影响，从而可以减少内质网中堆积的错误折叠或未折叠的蛋白质，减轻UPR，从而下调XBP1的表达。

通过本研究发现糖尿病大鼠肾脏中XBP1的表达增多，说明内质网氧化应激参与了糖尿病肾病的发生及进展，普罗布考可以通过降低内质网应激水平起到肾脏保护作用。

［1］DeCracia DJ.Montie HL.Cerebral ischemia and the urffolded orotein response［J］.Neurochem，2004，91（1）：1.

［2］Soslow RA，Dannenberg AJ，Rush D，et al.Cox－2is expressed in human pulmonary，colonic，and mammary tumors［J］.Cancer，2000，89（12）：2637.

［3］Wang FM，Galsonl DL，Roodman GD，et al.Resveratrol triggers the pro－apoptotic endoplasmic reticulum tress response and represses the pro－survival XBP1signaling in human multiple myeloma cells［J］.Exp Hematol，2011，39（10）：999.

［4］Gupta S，Deepti A，Libana F，et al.HSP72Protects Cells from ER Stress－induced Apoptosis via Enhancement of IRE1a－XBP1Signaling through a Physical Interaction［J］.PLoS Biology，2010，8（7）：e1000410.

［5］Zeng L，Zampetaki A，Margariti A，et al.Sustained activation of XBP1splicing leads to endothelial apoptosis and atherosclerosis development in response to disturbed flow［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，2009，106（20）：8326.

［6］张智博，唐 璐，彭 旭.参芎注射液对大鼠脑缺血再灌注后内质网应激相关分子X盒结合蛋白1表达的影响［J］.国际脑血管病杂志，2009，17（11）：844.

［7］Liu Y，Adachi M，Zhao S，et al.Preventing oxidative stress：a new role for XBP1［J］.Cell Death Differ，2009，16（6）：847.

［8］吕海涛，刘三光，穆宏凌，等.X一盒结合蛋白1、血管内皮生长因子C在肝癌中的表达及意义［J］.中华实验外科杂志，2012，29（8）：1535.

［9］薛 强，陈 勇，李生伟，等.XBPl信号转导通路对大鼠移植肝脏缺血再灌注损伤的影响及其机制［J］.中华气管移植杂志，2011，32（2）：69.

［10］Doom JA，Petersen DR.Coverlent modification of amino acid nucleophils by the lipid peroxidation products4－hydroxy－2－nonenal and 4－oxo－2－nonenal［J］.Chem Res Toxicol，2002，15（11）：1445.

［11］王雁飞，刘丽秋，刘桂美，等.糖尿病大鼠肾脏4羟基壬烯醛的表达及普罗布考的干预研究［J］.中华肾脏病杂志，2013，29（9）：692.

Expression of XBP1 in the kidney of diabetic rats and the protective effect of probucol

WANG Yu－qin，LIU Li－qiu，ZHANG

Wei，et al.（People’s Hospital of Juxian，Qingdao 276500，China）

ObjectiveTo investigate the expression of 4－HNE in the kidney of diabetic rats and the protective effect of probucal.Methods80rats were randomly divided into three groups：control group（group C），diabetic group（group D）and probucol treated group（group P），group D and group P were giwen STZ（60mg／kg）by intraperitoneal injection to establish rat model of diabetic.After rat model of diabetic succesfully established，rats in group P were treated by probukol（110mg／kg.d），rats in group D and group C were given equal volume water insdead.SCr、BUN、TG、TC and urinary protein were measured at the 4th、8th and 12th weeks.HE staining were used to evaluate the pathological change of the kidney.The immunohistochemistry and Western－blot were used to detect the expression of XBP1in renal tissue.ResultsThe serum creatinine、BUN、TG、TC and 24－hour urinary protein in group D and grou P were increased in 4th、8th and 12th weeks，and were higher than those in group C（P＜0.05）.The pathological changes of the kidney in group D were more serious than group P.The expression of XBP1in group P was significantly lower than group D，（P＜0.05），but was much higher than group C（P＜0.05）.ConclusionThe XBP1expression siginificantly increases in the kidney of STZ induced diabetic rats，Probucol can protects the diabetic kidney through decreasing the expression of XBP1and the leval of endoplasmic reticulumStress.

Diabetic nephropathy；Endoplasmic reticulum stress XBP1Probucol

R589.1

A

2014－03－10）

1007－4287（2015）02－0190－04

＊通讯作者