不同年份武夷水仙对肺癌细胞的影响

何 靓 杨江帆 屠幼英*

(1.浙江大学茶学系，浙江 杭州 310058； 2.武夷学院，福建 武夷山 354300)

不同年份武夷水仙对肺癌细胞的影响

何 靓1杨江帆2屠幼英1*

(1.浙江大学茶学系，浙江 杭州 310058； 2.武夷学院，福建 武夷山 354300)

本文研究了不同年份武夷水仙(2006、2007、2008和2009年)的主要生化成分，并通过MTT比色法测定比较了不同年份武夷水仙茶汤提取液的抗人类肺癌SPC-A1细胞的能力。结果表明：武夷水仙的抗癌能力不随存放时间增加而持续增强，其中2008年武夷水仙抑制肺癌细胞生长能力最强，茶褐素和茶色素总量与其抗癌能力有明显的相关作用。

乌龙茶；茶色素；肺癌细胞

肺癌是全球发病率和死亡率最高、增长最快的癌症之一。肺癌的病因虽然至今尚不明确，但是大量研究表明：长期吸烟与肺癌发病率有密切的关系，15%的主动吸烟者容易患上肺癌[1-2]。大量流行病学调查研究表明：茶能够预防和抑制肿瘤的发生，喝茶能使患肺癌的机率显著降低22%(RR：0.78，95% CI：0.70-0.87)[3]。茶叶对肺癌的抑制作用大多与保护正常细胞、修复受损细胞、抑制肺癌细胞和阻碍癌细胞的信息传递等作用有关[4]。其中，茶多酚及其氧化产物对癌细胞凋亡的诱导和促进作用密切相关[5-10]。

中国六大茶类之一的乌龙茶，又称青茶，主要产于我国福建、台湾和广东地区。研究表明，乌龙茶具有抗突变及抑制癌症的功效。叶飞[12]发现在50～100 μg·mL-1浓度时，乌龙茶对香烟烟雾水溶液(CSS)引起的人支气管上皮细胞(HBE)细胞损伤作用有较好的保护作用；许钢[13]研究认为，大量的亚硝胺类物质可影响基因表达而导致肿瘤的发生，而乌龙茶对亚硝胺合成有阻断作用以及对亚硝酸盐有清除作用；阮景绰[14]研究发现乌龙茶不仅能降低MNNG(N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍)诱发大鼠胃肠道恶性肿瘤的发生率，还能抑制肿瘤的生长和转移；周海虹等[15]研究得出乌龙茶水提物在体外对一些瘤细胞株有直接抑制作用，并在荷瘤动物活体上显示出明显的抗肿瘤作用。Naoko Niho[16]等从乌龙茶中提取的黄酮物质能够有效预防结肠癌。Hiroshige Hibasami[17]等研究表明乌龙茶中的多酚提取物能促进人结肠癌COLO 205细胞凋亡。但是，不同存放时间的乌龙茶及其提取物对肺癌细胞的作用未见详细研究报道。因此，本文拟研究不同年份武夷水仙对人类肺癌SPC-A1细胞的生长抑制作用，以期探究不同存放时间对乌龙茶抗癌能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 2006、2007、2008、2009年份的武夷水仙(武夷星公司，且为老嫩度相当的同一品种)；人肺癌细胞株A549(中科院上海细胞库)；RPMI1640培养基(Gibco公司)；新生牛血清(杭州四季青公司)。

1.1.2 试剂 乙腈、甲醇；碳酸氢钠；考马斯亮蓝G250；Sephadex LH- 20；正丁醇、冰乙酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、蒽酮等；水为实验室一级用水，电导率(25℃)为0.01 mS/m。

1.1.3 仪器 AL104 电子天平；DK-88电热恒温水浴锅；UV759S 紫外可见分光光度计；DGX-9073B-Z电热恒温鼓风干燥箱；LC2010高效液相色谱；P270半制备色谱，UV230+紫外可见检测器，EC2000色谱数据处理工作站等。

1.2 方法

1.2.1 茶汤浸提 茶汤浸提:称取1 g(准确至0.001 g)磨碎试样于150 mL锥形瓶中加沸蒸馏水80 mL，立即移入沸水浴中浸提30 min(每隔10 min摇动一次)。浸提完毕后立即趁热减压过滤，冷却后定容于100 mL容量瓶中。

1.2.2 基本生化成分测定 茶叶含水量的测定：采用103℃恒重法[18]；水浸出物含量的测定: 采用全量法[18]；多酚类含量的测定: 采用酒石酸铁比色法[18]；氨基酸含量的测定: 采用茚三酮比色法[18]；蛋白质含量的测定：采用考马斯亮蓝法[19]；茶黄素、茶红素、茶褐素的含量的测定：采用系统分析法[18]。

1.2.3 高效液相色谱( HPLC)法测定儿茶素组分 采用高效液相色谱( HPLC)法[20]。岛津LC-2010A液相色谱柱，色谱柱(Wondasil C18-WR柱，5 μm，i.d 4.6×250mm)。紫外检测波长280nm，柱温恒温15℃，进样量10μL。流动相A：乙酸∶乙腈∶水=0.5∶3∶96.5(V∶V∶V)；流动相B：乙酸∶乙腈∶水=0.5∶30∶69.5(V∶V∶V)；洗脱梯度：0-35 min，B相从30%-85%；40-70 min, B相从85%-85%, 共80 min；流速：1.0 mL/min。

1.2.4 武夷水仙儿茶素的分离制备[21]茶叶经热水浸提、过滤、浓缩、冷却后用乙酸乙酯萃取，酯相真空浓缩得浓缩液，冷冻干燥后得儿茶素粗提品。加水溶解至100 mL，过滤上Sephadex LH-20柱(D 2.5 cm×75 cm)，用丙酮/水梯度洗脱。

分离所得儿茶素浓缩去丙酮后，用甲醇溶解，然后采用半制备HPLC分离纯化儿茶素。液相柱(依利特10 mm×250 mm，10 μm粒径)，紫外检测波长280 nm，柱温为室温，进样量100 mg，分别以流动相1：水∶甲醇=34∶66(V∶V)和流动相2：水∶甲醇=38∶62(V∶V)等梯度洗脱，流速为5 mL/min，收集各个峰。

1.2.5 武夷水仙茶黄素、茶红素的提取 茶黄素的提取参见Collier[22]经典萃取方法。茶红素的提取参见Brown[23]方法。

1.2.6 细胞培养 细胞培养采用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基，置于37℃含5% CO2的细胞培养箱中培养。用0. 25% 胰蛋白酶和0. 02% EDTA消化、传代细胞。用0.22 μm的的无菌微型过滤器过滤3 mL茶汤，过滤后存放于无菌试管中。将20 μL的茶汤分别加入96孔板中。24 h后，显微镜观测细胞进行拍照。培养24 h后通过MTT比色法测定细胞存活率。

2 实验结果

2.1 不同年份武夷水仙的生化成分

2.1.1 不同年份武夷水仙主要成分含量 对4种不同年份武夷水仙进行主要生化成分测定，包括游离氨基酸、可溶性蛋白、咖啡碱、茶多酚、茶黄素(Theaflavins，TFs)、茶红素(Thearubigins，TR)、茶褐素(Theabrownin，TB)以及茶色素总量。

从表1中看出，不同年份武夷水仙中的氨基酸、可溶性蛋白含量无显著性差异，但是咖啡碱、茶多酚的含量随着存放时间的增加而递减，2006年武夷水仙中的咖啡碱含量与2009年相比减少14.55%，茶多酚含量减少23.74%。TFs含量随着存放时间的增加，先增加后减少，其中2007年水仙中TFs含量最高。随着存放时间的增加，水仙中的多酚类物质发生氧化反应，从而TFs含量增加，但当增加到一定程度，随着茶多酚的进一步氧化形成TR、TB，造成TFs含量下降。从表1中我们还可以看到，TR含量随着存放时间的增加而增加，而TB含量先增加后减少，其中2008年武夷水仙的含量最高。茶色素由TFs、TR、TB组成， 其中， 2008年武夷水仙茶色素含量最高，相较2009年水仙增加39.09%。随存放时间的增加，2007、2006年水仙中茶色素含量，相较2008年水仙分别降低12.49%、6.56%。

2.1.2 不同年份水仙的儿茶素含量 对不同年份武夷水仙中儿茶素及其单体的含量进行分析比较，结果如图1所示。对于GC、EC，2006年武夷水仙含量与2009年相比，分别下降了50%、44.4%；对于EGCG、EGC和儿茶素总含量，随着存放时间增加而含量降低，但是到2007年后趋于平稳。2009年武夷水仙存放时间最短，其EGCG、EGC、儿茶素总量含量最高。

图1 不同年份武夷水仙中儿茶素及其单体的含量

2.3 细胞实验结果

如1.2.1和1.2.6所述方法，用2006年至2009年武夷水仙的茶汤提取物对人类肺癌SPC-A1细胞进行处理，24h后用MTT比色法检测细胞抑制率，结果如图2所示。武夷水仙对SPC-A-1细胞具有抑制增殖的作用，2007年和2006年水仙的抑制效果无显著性差异，但都显著高于2009年水仙。2008年水仙的肺癌细胞抑制效果最为显著。

图2 不同年份武夷水仙对肺癌SPC-A1细胞的抑制率

图3 (左)为未经处理的培养24 h后的肺癌细胞，(右)为2009年武夷水仙作用24 h后的肺癌细胞

图3(左)为对照组，即培养了24小时的未经处理的人肺癌SPC-A-1细胞，而图3(右)是用2009年武夷水仙处理24小时后用显微镜观察到的肺癌细胞。从图中可看出，对照组的细胞生长良好，细胞间接触紧密，而经过2009年水仙处理后的人肺癌SPC-A1细胞，细胞密度减小、变圆、皱缩。另外，经其他年份水仙处理的肺癌细胞形态变化更加明显。图2所示MTT 检测结果以及图3所示武夷水仙对SPC-A-1细胞增殖抑制的形态学变化，都证实了武夷水仙对人肺癌 SPC-A-1 细胞增殖有抑制作用。

比较不同年份武夷水仙的抗癌能力，从图2可看出，2008年武夷水仙的细胞生长抑制作用效果最强，随着存放时间的增加，细胞抑制率先升高后降低。首先，2008年水仙与2009年水仙相比，虽然2008年水仙中儿茶素、茶红素、咖啡碱含量低于2009年水仙，但是其TB和茶色素总量却都显著高于2009年水仙，TB和茶色素总量很可能是导致二者抗癌能力差异的原因之一。2007、2006年武夷水仙细胞抑制率(76.2%、75.7%)都低于2008年(83.2%)，但是却高于2009年水仙(62.4%)。这与表1中2007、2006年武夷水仙中的TB、茶色素总量都比2008年水仙减少，但比2009年水仙增加的结果相一致。

3 结 论

随存放时间增加，武夷水仙的咖啡碱、茶多酚及其儿茶素的含量递减；TR含量随之增加；TFs含量先增加后减少，在2007年武夷水仙中达到峰值0.32%；TB和茶色素总量都先增加后减少，但在2008年武夷水仙中分别达到峰值7.91%、12.81%。

MTT 检测结果和显微镜观察显示武夷水仙能抑制人肺癌 SPC-A-1 细胞增殖，其抗癌能力不随存放时间增加而持续增强，2008年武夷水仙的细胞生长抑制作用比其他年份武夷水仙强。分析发现其TB含量和茶色素总量最高，因此TB、茶色素总量很可能是影响其抗癌能力的重要原因之一。尽管对茶褐素的构成尚未完全清楚，我们无法准确测定样品中的茶褐素组成结构，但是根据所得实验结果分析，茶褐素对SPC-A1细胞的生长是有影响的，茶褐素的组成结构值得进一步研究。

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The effect of WuYi ShuiXian Teas produced in various years on human lung cancer cells

HE Jing1， YANG Jiangfan2， TU Youying1*

(1.Tea Science Department of Zhejiang University， Hangzhou， Zhejiang， 310058;2.Wuyi University， Wuyishan， Fujian， 354300)

The major biochemical components of WuYi ShuiXian teas produced in various years from 2006 to 2009 and their effects on human lung cancer were investigated. The results showed that the storage time would not always enhance the anti cancer ability and that produced in 2008 had the strongest inhibition effect on the lung cancer cells. The anti-cancer ability was correlated to the levels of of theabrownin (TB) and tea pigments.

oolong tea; tea pigments; lung carcinoma cells

2015-10-22

中国乌龙茶产业协同创新中心(培育)2013-2016

何靓(1990年-)，女，湖北人，硕士研究生，主要从事茶叶生物化学及其综合利用研究。

TS272.5+<9;R734.2 文献标识码：A class="emphasis_bold">9;R734.2 文献标识码：A 文章编号：0577-8921(2015)04-192-049;R734.2 文献标识码：A

0577-8921(2015)04-192-04

A 文章编号：0577-8921(2015)04-192-04

*通讯作者：youytu@zju.edu.cn