4个Y-miniSTR基因座荧光标记复合扩增体系的建立



4个Y-miniSTR基因座荧光标记复合扩增体系的建立

王惠1，白小刚1，夏昱1，李庆庆1，何望2，梁伟波2

(1.成都市公安局刑侦局，四川成都610081;2.四川大学华西基础医学与法医学院法医物证学教研室，四川成都610041)

【摘要】目的:构建DYS456，DYS392，DYS439，Y-GATA-H4等4个Y-miniSTR基因座复合扩增体系，评价其检测敏感度、数据库兼容性和对降解检材的分型能力。方法:设计4个Y-miniSTR的引物，用FAM、JOE、ROX、TAMRA分别标记其上游引物，构建复合扩增体系。利用本体系的引物扩增稀释过的Y23试剂盒的ladder，制备等位基因分型标准物。比较该体系与Promega PowerPlexⓇY23试剂盒在普通检材、降解检材的分型能力、敏感度和分型结果。结果:同一样本体系分型结果和商业化试剂盒Y23 STR分型结果相同，4个Y-miniSTR复合扩增体系和对降解检材的分型成功率更高，敏感度一致，具有数据库兼容性。结论:本研究中的4个Y-miniSTR复合扩增体系对降解检材的检测具有应用价值，敏感性较好，具有数据库兼容性，可以作为对降解检材分型时商业化试剂盒的补充。

【关键词】法医物证学;复合扩增体系; miniSTR; Y染色体;降解DNA;低模版DNA

短串联重复序列(short tandem repeats，STR)是广泛存在于人类基因组中的一类具有长度多态性的DNA序列，由2～6 bp顺序相同的重复序列单位首尾串联重复排列组成。目前，STR分型是国内外法医个人识别和亲权鉴定的最主要的手段。

Y染色体短串联重复序列(Y-STR)由于其单倍型父系遗传特点，在法医学和群体遗传学中具有重要而独特的作用［1］。在法医学个人识别、亲权鉴定中，对于各种形式的混合斑如精液与阴道液，含有男性成分的体液斑等的检验中［2］，可直接检测Y-STR确定男性个体;在假设父缺席时可借助男系的男性亲属对男性的子代进行亲权鉴定。因此Y-STR越来越受到法医学工作者的重视［3］。

在实际检案过程中，检材所处环境复杂，不利于DNA的保存。在应用商品化STR试剂盒进行DNA分型时可能出现优势扩增或者无效扩增，无法获得合格的分型结果，进行高度降解的DNA的STR分型成为法医检验的难点［4］。mini-STR技术即设计引物时尽量缩小扩增子的长度［5］，在高降解检材STR分型中逐渐受到研究者的重视［6］。

本研究旨在建立新型的4个Y-miniSTR基因座荧光标记复合扩增体系，并对其法医学应用进行初步研究。

1　材料和方法

1.1DNA制备

12份中国汉族健康无关男性个体血液样本来自四川大学华西法医鉴定中心，其中3份使用酚氯仿法(试剂购于成都瑞信生物公司)提取DNA，剩余9份使用百泰克全血基因组DNA快速提取试剂盒提取DNA，使用Thermo Fisher NanoDrop1000紫外分光光度计对DNA进行定量。

利用酚氯仿法提取的3份DNA进行超声波降解制作高降解DNA。使用宁波新芝JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机，超声10 s，间隔4 s，功率500 W，分别超声100次，200次，300次，400次。

1.2引物设计及合成

引物序列来源于NIST网站(http://www.cstl.nist.gov/div831/strbase/)，由Invitrogen公司合成。引物序列等详情见表1，表2。

表1　引物序列及荧光标记

表2　扩增子长度及引物浓度

1.3PCR扩增体系及热循环参数

本体系使用QIAGEN-Multiplex试剂盒进行复合扩增。扩增体积10 μL，扩增使用东胜EDC-810基因扩增仪。DNA模版1 ng，混合引物(表2)2 μL，2x Master Mix 5 μL，PCR扩增水补齐至10 μL。复合扩增参数:95℃预变性15 min: 30次循环(94℃30 s，60℃90 s，72℃60 s);60℃延伸30 min，4℃保存。

PowerPlex Y23扩增条件为，扩增体积10 μL，扩增使用东胜EDC-810基因扩增仪。DNA模版1 ng，5x Master Mix 2 μL，10x Primer Pair Mix 1 μL，PCR扩增水补齐至10 μL。复合扩增参数: 96℃预变形2 min，30次循环(94℃10 s，61℃1 min，70℃30 s)，60℃延伸20 min，4℃保存。

1.4毛细管电泳分型

本体系PCR产物利用ABI3130遗传分析仪检测分析。本体系PCR产物1 μL，AGCU-SIZ500内标0.15 μL，Hi-Di formamide 8.85 μL，混匀编号，95℃变性后放入自动进样盘。电进样15 KV、5 s，电泳28 min。Data Collection软件收集数据，GeneMapper-ID V3.2软件进行分型。Y23试剂盒PCR产物按照说明书使用ABI3130进行操作，GeneMapperID V3.2软件进行分型。

2　结果

2.1一致性分析

本实验中12份人血DNA，2 800 M标准DNA 的STR分型结果和Y23试剂盒相同，本体系2 800 M标准DNA分型图见图1。

图1　本体系2 800 M标准DNA分型结果

2.2低模版DNA分型结果

对不同浓度的2 800 M DNA进行STR分型，Y23试剂盒最低可对模版量为50 pg的DNA成功分型;本体系最低可对模版量为50 pg的DNA成功分型，平均峰高比Y23试剂盒结果更高。出峰数、平均峰高等详见表3。

表3　低模版DNA分型结果

2.3降解检材分型结果

对超声降解样本进行STR分型，Y23试剂盒在超声100次及200次成功分型，超声300次及400次的样本时出现大片段等位基因丢失现象;本体系仅在一个样本400次超声降解DNA的DYS439出现等位基因丢失，其余都能成功分型，平均峰高比Y23试剂盒更高，出峰数、峰高等详见表4，分型图见图2、图3。

表4　超声降解检材分型结果

图2　Y23-300次超声分型结果

图3　本体系-400次超声分型结果

3　讨论

mini-STR技术即设计引物时，使其尽可能结合在更靠近核心重复序列的侧翼序列，使PCR扩增产物尽可能缩短，对降解的DNA小片段分型成功率相对更高［7］。如果miniSTR基因座是商品化试剂盒中的STR基因座，这些miniSTR基因座具有一个很明显的优势:数据库兼容性。在法医现场工作中收集到的降解DNA样品，用miniSTR技术进行DNA分型，结果可以与用商品化STR试剂盒做出的犯罪嫌疑人结果进行比较，从而认定罪犯。本研究着重于Y-STR位点，和常染色体STR位点相比，Y-STR位于Y染色体特异区，呈稳定的父系遗传，除突变外，父亲的Y-STR特征将毫无变化地传给儿子，使其在混合斑鉴定、父系亲属间亲权鉴定和群体遗传学中有重要作用。单独检测Y-STR，即可获得混合斑中的男性成分的信息;利用Y染色体呈整体单倍型父子遗传的特性进行父子之间的亲权鉴定，可大大提高亲权指数;由于Y染色体的特殊性，Y-STR多态分布具有显著的人群、地域分布特征，不同种族、民族和不同地域甚至不同家族的Y-STR具有明显差异性。通过对这种差异的分析，可直接反映出人群或种族父系历史，可提示嫌疑人的群体来源背景。这种差异还有望用于涉及法律的移民问题和亲缘关系的鉴定，以及不同种族、民族、不同区域人群的鉴定。

在本研究中，同一样本本体系分型结果和商业化试剂盒Y23［8］STR分型结果相同，扩增子长度符合理论计算，无非特异性扩增，说明本体系引物设计正确;对低模版检材进行分型时，Y23试剂盒可对模版量最低为50 pg的样本成功分型，本体系可对模版量最低为50 pg的样本成功分型，说明本体系反应条件优化良好，对DNA模版量要求不高，有利于实际检案的使用;对高降解检材进行分型时，Y23试剂盒在300次超声及以上的DNA样本无法成功分型，而本体系能对300次超声的样本成功分型，400次超声的样本仅在一个样本中丢失一个位点，本体系对降解检材的STR分型能力高于Y23试剂盒，在实际检案面临降解DNA时，本体系可作为对Y23试剂盒的补充，对Y23试剂盒不能成功分型的4个大片段STR位点进行分型。目前商业化的miniSTR试剂盒有中德美联AGCU + mini，Applied Biosystems AmpFlSTRminifiler。AGCU mini试剂盒包括Amelogenin，D19S253、Penta D、Penta E、D2S1338、D19S433、CSF1PO、D12S391、D6S1043等9个位点，AmpFlSTRminifiler包括Amelogenin、D13S317、D7S820、D2S1338、D21S11、D16S539、D18S51、CSF1PO、FGA。这两个试剂盒都没有包含Y-miniSTR位点。有研究认为，AGCU mini和Mini-FIler在10 μL体系中能对40 pg以上的模版成功分型［9-10］，本研究中的Y-miniSTR体系可对模板量50 pg以上的样本成功分型。法医学者对常染色体和X染色体上的miniSTR进行了大量研究，Israr等［11］进行了12个X-miniSTR的研究，Wang等［12］进行了常染色体STR的研究。Y-miniSTR的研究较少，位点集中在商业化试剂盒中未出现的位点，不具有数据库兼容性，位点等位基因数少，多态信息量一般。本文中选取的位点是商业试剂盒中的位点，有良好的数据库兼容性，位点等位基因数较多，多态信息量更好，研究者们进行了大量群体遗传学调查，在YHRD(Y Chromosome Haplotype Reference Database，www.yhrd.org)数据库中有着大量Y23的群体遗传学数据。

本文建立了新型的4个荧光标记Y-miniSTR复合扩增体系，4个位点为DYS456，DYS392，DYS439，Y-GATA-H4，都是存在于Y23试剂盒中的位点，扩增产物在81～44 bp之间，并对其法医学应用进行初步研究。通过和商业化试剂盒Y23同一样本分型结果的对比，显示分型结果一致;利用超声降解制备降解DNA，在300次超声及以上的降解DNA分型时，本体系和Y23试剂盒相比有着更好的分型成功率;在低模版DNA的STR分型时，本体系和Y23试剂盒检测灵敏度一致。仅4个位点的复合体系还不足以进行个人识别和亲子鉴定，在以后的研究中，将增加位点数，使本体系能够进行个人识别和亲子鉴定。本体系尚未建立MATRIX文件，绿色荧光对蓝色和黄色荧光的影响较大，在后续研究中将建立MARIX文件，优化反应条件，提高检测灵敏度、稳定性和平衡性;并对本系统的多态性、各种法医学参数、各种不同检材的适用性进行深入的研究。

参考文献

［1］Ambers A，Gill-King H，Dirkmaat D，et al.Autosomal and Y-STR analysis of degraded DNA from the 120-year-old skeletal remains of Ezekiel Harper［J］，Forensic Sci Int Genet，2014，9:33-41.

［2］Barra GB，Santa Rita TH，Chianca CF，et al.Fetal male lineage determination by analysis of Y-chromosome STR haplotype in maternal plasma［J］.Forensic Sci Int Genet，2014，pii: S1872-4973 (14)00246-4.

［3］Purps J，Siegert S，Willuweit S，et al.A global analysis of Y-chromosomal haplotype diversity for 23 STR loci［J］.Forensic Sci Int Genet，2014，12:12-23.

［4］Alaeddini R，Walsh SJ，Abbas A.Forensic implications of genetic analyses from degraded DNA—a review［J］.Forensic Sci Int Genet，2010，4(3):148-157.

［5］Butler JM，Shen Y，McCord BR.The development of reduced size STR amplicons as tools for analysis of degraded DNA［J］.J Forensic Sci，2003，48(5):1054-1064.

［6］Coble MD.Capillary electrophoresis of miniSTR markers to genotype highly degraded DNA samples［J］.Methods Mol Biol，2012，830:31-42.

［7］Odriozola A，Aznar JM，Celorrio D，et al.Recent advances and considerations for the future in forensic analysis of degraded DNA by autosomic miniSTR multiplex genotyping［J］.Recent Pat DNA Gene Seq，2011，5(2):110-116.

［8］Davis C，Ge J，Sprecher C，et al.Prototype PowerPlexⓇY23 System: A concordance study［J］.Forensic Sci Int Genet，2013，7 (1):204-208.

［9］苏艳佳，吴微微，郝宏蕾，等.AGCU Mini系统在法医学中的应用［J］.中国法医学杂志，2012，27(3):219-221.

［10］唐建平，吴丹，张晨，等.MiniFiler试剂盒运用于法医微量物证的检验［J］.法医学杂志，2007，23(4):304-306.

［11］Israr M，Shahid AA，Rahman Z，et al.Development and characterization of a new 12-plex ChrX miniSTR system［J］.Int J Legal Med，2014，128(4):595-598.

［12］Wang HD，Ruan JG，Shen CM，et al.Polymorphic distribution and forensic effectiveness study of eight miniSTR in Chinese Uyghur ethnic group［J］.Mol Biol Rep，2014，41(4):2371-2375.

网络出版时间: 2015-3-5 12∶47网络出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20150305.1247.002.html

Development of a new quadruplex ChrY miniSTR system

WANG Hui1，BAI Xiao-gang1，XIA Yu1，LI Qing-qing1，HE Wang2，LIANG Wei-bo2

(1.Institute of Forensic Science，Chengdu Public Security Bureau，Chengdu 610081;2.Department of Forensic Biology，West China School of Preclinical and Forensic Medicine，Sichuan University，Chengdu 610041，Sichuan，China)

【Abstract】Objective: A quadruplex of primers aimed at 4 Y-chromosomal short tandem repeat(Y-STR)loci(DYS456，DYS392，DYS439，Y-GATA-H4)was built.The length of 4 amplicons was all shorter than 150bp which was called miniSTR.An examination was carried out for sensitivity，DNA database compatibility and degraded DNA typing ability of the quardplex.Methods: 4 primers of Y-STR(DYS456，DYS392，DYS439，Y-GATA-H4)were specially selected for short amplicons.The front primer of DYS456，DYS392，DYS439，Y-GATA-H4 was labeled with FAM，JOE，ROX，TAMRA separately.DNA samples were collected from forensic cases.And degraded samples were made by ultrasonic impact treatment.Ladder of the quadruplex was amplified from dilution of Y23 Ladder with the quadruplex primers.The quadruplex was compared to promega Y23 for sensitivity，DNA database compatibility and highly degraded DNA typing ability.Results: Sensitivity of the quardplex was the same as Y23 in both common samples and highly degraded samples.As a result of test on degraded DNA samples using the quadruplex systems，the systems proved to be an more effective tools for analyzing degraded DNAs than Y23.And there were no differences in DNA typing results which means great DNA database compatibility.Conclusion: The quadruplex of Y-miniSTR in addition to the commercial available Y-STR multiplex kits are highly useful for forensic practices of degraded DNA samples.

【Key words】Forensic Genetics; Multiplex kits; MiniSTR; Ychromosome; Degraded DNA; Low temple DNA

通讯作者:梁伟波，E-mail: liangweibo@scu.edu.cn

作者简介:王惠(1968-)，女，四川古蔺人，副主任法医师，主要从事法医物证学研究。

基金项目:国家自然科学基金项目(81471827，81202387);四川省公安厅重点攻关及应用创新项目(201303)

收稿日期:2014-11-14

doi:10.3969/j.issn.1005-3697.2015.01.02

【文章编号】1005-3697(2015)01-0006-05

【中图分类号】D919

【文献标志码】A