党参水提物对D-半乳糖致衰老模型小鼠肝、肾线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ酶活性及线粒体结构的影响*

耿广琴，杨雅丽，李 扬，黄 勇

(甘肃中医学院基础医学院，甘肃 兰州 730000)

·实验研究·

党参水提物对D-半乳糖致衰老模型小鼠肝、肾线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ酶活性及线粒体结构的影响*

耿广琴，杨雅丽，李 扬，黄 勇

(甘肃中医学院基础医学院，甘肃 兰州 730000)

目的:研究党参水提物对D-半乳糖致衰老模型小鼠肝、肾线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ酶活性和线粒体结构的影响，探讨党参在延缓衰老中的作用及其机制。方法:将100只小鼠随机分为正常对照组、模型对照组和党参水提物低、中、高剂量组5组。除正常对照组外，其余4组每日每只小鼠颈背部皮下注射5% D-半乳糖溶液，注射量为0.025 mL/ g，正常对照组注射同体积生理盐水。党参低、中、高剂量组每日上午依次按相当于生药量 5，10，15 g/kg个剂量给致衰老小鼠灌服党参水煎液，与造模同步，连续服药 42 d。采用分光光度法测定肝、肾线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ酶活性，电镜观察肝、肾线粒体结构损伤。结果：党参水提物中、高剂量组小鼠肝、肾线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ酶活性均升高，其中高剂量组的肝、肾线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ酶活性与模型对照组对比，差别有统计学意义(P<0.01)。党参水提物高剂量组小鼠肝、肾线粒体结构异常变化明显改善，党参水提物高剂量组肝、肾线粒体损伤程度显著低于模型对照组(P<0.05)。结论:高剂量的党参水提物能通过某种机制减缓或阻止线粒体结构的异常改变，改善或维持其正常功能的执行, 起到延缓衰老的作用，具体的机制还有待进一步的研究。

党参水提物/药效学；衰老/药物作用；D-半乳糖致衰老模型；线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ酶活性；线粒体结构；动物模型；小鼠

衰老的过程复杂，受多种因素调控[1]。衰老既是一种病理变化, 又是一种不可逆转的生理过程；但是，延缓衰老是完全可能的[2]。线粒体是细胞进行氧化磷酸化、产生能量的主要场所，是细胞的“动力工厂”，同时线粒体也是机体产生氧自由基的主要场所[3]。研究表明，线粒体结构和功能异常与衰老的发生发展密切相关[4-5]。本研究通过研究党参水提物对D-半乳糖致衰老模型小鼠肝、肾线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ酶活性和线粒体结构的影响，探讨中药党参在延缓衰老中的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 动 物

SPF级2月龄昆明种小鼠100只，雌雄各半，体质量(18±2) g，购自甘肃中医学院科研实验动物中心，合格证号:SCXK(甘) 2011-0001。

1.2 药品、试剂与仪器

党参采自甘肃岷县，经甘肃中医学院中药学教研室鉴定为白条党参。取党参100 g，分2次煎煮，第1次加10倍量水煎煮1 h，第2次加6倍水煎煮1 h，合并两次提取液，过滤后，浓缩成含生药0.5 g/mL的水煎剂，置4 ℃冰箱备用，水煎液每5d制备1次。D-半乳糖，美国Sigma公司产品,批号G-0625，临用前用生理盐水配制成质量分数12 g/L的溶液；动物细胞/组织活性线粒体分离试剂盒(批号GMS10006.2)、纯化线粒体冻存液(酶学和膜结构保护)(批号GMS12198.1)、Bradford蛋白质浓度定量试剂盒(批号GMS30030.1)、动物线粒体呼吸链复合物Ⅰ(NADH-辅酶Q还原酶)活性定量检测试剂盒(批号GMS50007)、动物线粒体呼吸链复合物Ⅳ(正铁细胞色素C-氧化还原酶)活性定量检测试剂盒(批号GMS50010)，均购自上海杰美基因医药科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。BS224S型电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司产品；HH-4数显恒温水浴锅，郑州杜甫仪器厂产品；XYJ80-20型离心机，金坛市恒丰仪器厂产品；XW-80A型旋涡混匀器，上海精科实业有限公司产品；UV754N型紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司产品；JEOL-1230透射电子显微镜，日本电子公司产品。

1.3 动物分组及模型的建立

将100只小鼠随机分为正常对照组、模型对照组和党参水提物低、中、高剂量组5组，每组20只，雌雄各半。模型对照组和党参水提物低、中、高剂量组每日每只小鼠颈背部皮下注射50 g/L D-半乳糖溶液，注射量为0.025 mL/g；正常对照组小鼠注射等体积生理盐水。党参低、中、高剂量组每日上午依次按相当于生药量 5，10，15 g/kg剂量灌服党参水煎液，正常对照组和模型对照组灌服等体积生理盐水，与造模同步，连续服药 42 d。

1.4 检测指标

1.4.1 肝、肾组织线粒体制备

于末次给药2 h后，称量各组小鼠体质量，断头处死小鼠，迅速剖取肝、肾，用预冷的4℃生理盐水洗净表面残血备用。剪取大鼠肝、肾组织，按照试剂盒所示方法进行线粒体的提取，用Bradford蛋白质浓度定量法测定线粒体蛋白含量，调整蛋白浓度在10～20 g/L。各组线粒体蛋白悬液分装，于-80 ℃保存，保存时间不超过2周。

1.4.2 线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ酶活性测定

测定前将线粒体蛋白置于-20 ℃/20 ℃反复冻融 3 次，使之成为线粒体膜片段以达到最大酶活性。线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ酶活性测定的具体操作步骤严格按照相应定量检测试剂盒产品说明书进行。复合体Ⅰ的活性单位以每毫克线粒体蛋白每分钟消耗NADH的纳摩尔数表示，即nmol/(min·mgpro)。复合体Ⅳ的活性单位以每毫克线粒体蛋白每分钟氧化cytC的纳摩尔数表示，即nmol/(min·mgpro)。

1.4.3 超微结构观察

笔者前期研究了党参水提物对小鼠肝、肾组织中SOD活性、MDA含量的影响[7]，结果显示高剂量党参水提物延缓衰老的作用更为理想，因此本项指标检测中，仅对党参水提物高剂量组小鼠的肝、肾细胞线粒体的超微结构进行了观察。取大鼠肝及肾皮质组织结构1 mm3；分别固定于1/15 mol/L磷酸缓冲液(PBS)配制的体积分数30 mL/L戊二醛固定液2 h，PBS液漂洗3次，每次10 min；10 g/L锇酸固定1.5 h，PBS液漂洗3次，每次10 min；以500，700，800，900，1 000 mL/L乙醇梯度脱水，每次10 min，纯丙酮脱水2次，每次10 min；1∶1EPON-812环氧树脂∶纯丙酮浸透2 h；EPON-812环氧树脂包埋；35 ℃下24 h、45 ℃下24 h、65 ℃下24 h 聚合；半薄切片，甲苯胺蓝染色；光镜下定位，超薄切片； 透射电子显微镜观察。

采用Flameng分级法[6]对线粒体损伤程度进行半定量评分，在每个标本中随机选择5个视野，每个视野内随机观察20个线粒体，根据损伤程度分为0～4 5个等级。0级(无损伤)：线粒体结构正常，有颗粒状沉淀物；1级(轻度损伤)：线粒体嵴和基质正常，但无颗粒状沉淀物；2级(中度损伤)：基质颗粒消失，基质透明，无嵴破裂；3级(重度损伤)：基质颗粒消失，基质普遍透明，嵴破裂；4级(极其严重损伤)：基质颗粒消失，嵴普遍破裂，线粒体呈空泡样变。根据观察结果，计算每个标本线粒体损伤级数的平均分。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 各组小鼠肝、肾线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ酶活性对比

模型对照组小鼠的肝、肾线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ酶活性较正常对照组明显降低，差别有统计学意义(P<0.01) 。党参水提物中、高剂量组小鼠肝、肾线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ酶活性均升高，其中高剂量组的肝、肾线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ酶活性与模型对照组对比，差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表1。

表1 各组小鼠肝、肾线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ酶活性对比

表1 各组小鼠肝、肾线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ酶活性对比

组 别动物数剂量/(g·kg-1)复合体Ⅰ酶活性肝肾复合体Ⅳ酶活性肝肾正常对照组20—11．76±0．72∗∗8．14±0．61∗∗52．44±2．31∗∗49．44±3．78∗∗模型对照组20—7．75±0．423．93±0．6838．57±1．3429．09±2．63党参水提物低剂量组2057．66±0．484．03±0．4438．93±1．7827．26±2．38党参水提物中剂量组20109．81±0．356．02±0．3443．15±2．2834．78±3．06党参水提物高剂量组201511．02±0．67∗∗7．01±0．84∗49．63±4．63∗∗41．92±3．00∗

注：与模型对照组对比，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 各组线粒体形态学改变及损伤程度评分

电镜观察显示：正常对照组小鼠肝细胞线粒体圆形，肾细胞线粒体长椭圆形，线粒体数量较多，结构完整清晰。模型对照组小鼠线粒体肿胀、线粒体内膜和外膜的完整性时有破坏，嵴排列紊乱、断裂、减少或消失，基质变稀薄，电子密度降低，线粒体空泡样变。党参水提物高剂量组小鼠肝、肾线粒体结构异常变化明显改善，其中肝细胞中线粒体肿胀明显减轻，多数线粒体结构恢复正常；肾细胞线粒体结构也明显缓解，但个别线粒体仍存在一定程度的水肿、嵴排列紊乱及断裂的现象。见图1，2。

图1 肝细胞线粒体变化

图2 肾细胞线粒体变化

线粒体损伤级别计算结果显示：正常对照组、党参水提物高剂量组肝、肾线粒体损伤程度均低于模型对照组，差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表2。

表2 各组小鼠肝、肾线粒体损伤级数的平均分对比 分

注：与模型对照组对比，*P<0.05，**P<0.01。

3 讨 论

线粒体是真核生物重要的细胞器，是细胞呼吸产生能量(ATP)的主要场所。衰老的线粒体学说认为线粒体是细胞衰老与死亡的分子基础[8]，衰老源于线粒体[9]，是衰老发生的根源所在。

呼吸链酶复合体Ⅰ～Ⅳ是线粒体呼吸链的组成成。复合体I位于线粒体呼吸链的起始端，在代谢反应中，大部分代谢物脱下的2H是由NAD+接受，形成NADH+H+，经复合体Ⅰ进行传递，这条氧化呼吸链被称为NADH氧化呼吸链，是机体最普遍的一条氧化呼吸链。复合体Ⅳ又称为细胞色素C氧化酶，位于线粒体呼吸链的末端，最易被氧化损伤[10]。有文献报道，衰老时线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ及Ⅳ等活性下降，氧化磷酸化能力相应减弱，导致细胞能量不足，引起衰老和老年病的发生[11]。本研究结果显示：模型对照组小鼠肝、肾线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ酶活性较正常对照组显著降低，给予高剂量的党参水提物后，酶活性显著升高，说明高剂量党参水提物可通过增强线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ酶活性，确保电子传递的正常进行，进而改善或维持衰老小鼠线粒体呼吸链的功能。

线粒体超微结构观察结果显示，衰老模型小鼠肝、肾细胞线粒体超微结构发生了明显改变，表现为内膜断裂、消失，线粒体呈现空泡样变。线粒体的主要功能是进行氧化磷酸化和三羧酸循环，前者在线粒体内膜上进行，产生ATP；后者在线粒体基质内进行，是3大营养物质糖、脂肪、蛋白质的最终代谢通路。其重要作用在于为氧化磷酸化反应提供还原当量。结构是功能的基础，结构异常改变，必然会影响其正常功能的发挥。高剂量党参水提物明显减慢或阻止了线粒体结构的异常变化，对线粒体结构的完整起到了积极保护作用。

综上所述，线粒体结构的损伤，呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ酶活性的下降，影响了线粒体氧化磷酸化或三羧酸循环的进程，导致ATP生成减少、细胞供能不足，可能是衰老发生的一个重要原因。高剂量的党参水提物能通过某种机制减缓或阻止线粒体结构的异常改变，增强线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅳ酶活性，维持线粒体正常功能的执行，进而起到延缓衰老的作用，具体的机制还有待进一步的研究。

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(编辑 陶 珠)

1001-6910(2015)01-0067-04

R285.5

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.01.33

耿广琴(1971—)，女(汉族)，河南开封人，动物学硕士，现甘肃中医学院基础医学院生化教研室教师，主要从事生物化学的教学及研究。

李杨，讲师，657061621@qq.com

甘肃省教育厅科研项目 (2013A-087)

2014-05-03；

2014-10-31