《伤寒论》桂枝、甘草配伍对心阳虚证大鼠心肌能量代谢酶活性的影响*

姚凤云，刘 成，刘春花，王炳志

(江西中医药大学基础医学院，江西 南昌 330004)

·实验研究·

《伤寒论》桂枝、甘草配伍对心阳虚证大鼠心肌能量代谢酶活性的影响*

姚凤云，刘 成，刘春花，王炳志

(江西中医药大学基础医学院，江西 南昌 330004)

目的：以能量代谢相关酶为考核指标，探讨《伤寒论》桂枝、甘草配伍“辛甘化阳”的内涵。方法：将大鼠按体质量随机分为正常对照组、模型对照组和桂枝、甘草不同配伍1～8组。采用盐酸普罗帕酮诱导大鼠心阳虚证模型。动物末次给药后50 min，剪取相同部位心肌组织0.1 g左右，制成100 g/L的匀浆液，离心，分离上清液，检测组织超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、Ca2+-Mg2+ATP酶和Na+-K+ATP酶活力。结果：《伤寒论》桂枝、甘草各配伍组均能提高大鼠心肌组织SOD、GPX、Ca2+-Mg2+ATP酶、Na+-K+ATP酶活力，其中配伍4组的SOD、配伍5组的GPX、配伍3组的Ca2+-Mg2+ATP酶和Na+-K+ATP酶活力与其相对应的模型对照组对比，差别有统计学意义(P<0.05)。结论：《伤寒论》桂枝、甘草配伍辛甘化阳配伍原理的内涵与干预心阳虚证大鼠心肌组织能量代谢酶有关，其作用的发挥与桂枝、甘草配伍比例及煎煮时间密切相关。

《伤寒论》；桂枝；甘草；心阳虚证；辛甘化阳；能量代谢；配伍原理

《伤寒论》作为一部以治疗狭义伤寒证为主的经典著作，“辛甘化阳”思想贯穿其始末，笔者通过对《伤寒论》113方的配伍分析,将其“辛甘化阳”法在方剂中的作用归纳为9个方面[1]，代表配伍如桂枝、甘草、干姜、甘草、附子与甘草等，其中桂枝、甘草配伍是《伤寒论》中“辛甘化阳”出现频率最高的一组，共有36首方，占方剂总数的31.86%。从滋阴和阳的桂枝汤到调和阴阳的小建中汤、从温通心阳的桂枝甘草汤到气血阴阳并调的炙甘草汤，无不是桂枝、甘草的配伍。因此，本课题以桂枝、甘草配伍药组为切入点，采用均匀设计方法，从能量代谢酶层面，对其“辛甘化阳”的内涵进行研究，旨在阐明二者配伍“辛甘化阳”的科学本质，为临床应用该配伍理论提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动 物

SFP级SD雄性大鼠，44～47日龄，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘)2011-0003。

1.2 药品、试剂与仪器

桂枝(批号301103871，产地广西)、甘草(批号301133667，产地内蒙古)，均购自北京同仁堂(亳州)饮片有限公司。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、超微量Ca2+-Mg2+ATP酶、超微量Na+-K+ATP酶试剂盒，均由南京建成生物工程研究所生产，批号依次为20131119，20131121，20131122，20131122。 UV1800紫外可见分光光度计，日本岛津公司产品；Tissuelyser 24型全自动样品快速研磨仪，上海净信实验设备科技部产品；CT14RD型低温冷冻离心机，上海天美生化仪器设备工程有限公司产品；BT25S电子分析天平(十万之一)，赛多利斯科学仪器公司产品。

1.3 桂枝、甘草配伍设计

《伤寒论》桂枝、甘草配伍，桂枝用量最大五两(25 g)，最小六铢(1.25 g)；甘草用量最大四两(20 g)，最小六铢(1.25 g)。采用均匀设计法，具体因素水平及均匀设计见表1～3。

表1 桂枝、甘草不同配伍因素水平表

表2 均匀设计表U8*(85)

表3 均匀设计表U8*(85)使用表

1.4 动物分组

大鼠常规饲养1周后，按体质量随机分为10组，即正常对照组、模型对照组和桂枝、甘草不同配伍1～8 组，即A1B4C7(配伍1组)、A2B8C5(配伍2组)、A3B3C3(配伍3组)、A4B7C1(配伍4组)、A5B2C8(配伍5组)、A6B6C6(配伍6组)、A7B1C4(配伍7组)和A8B5C2(配伍8组)，具体配伍剂量见均匀设计表2，每组10只。

1.5 药物制备方法

桂枝、甘草各配伍剂量组药物加10倍量水，浸泡30 min;按照表2设计，煎煮2次;4层纱布过滤，合并两次滤液;浓缩至1∶1药液(即1 g生药/mL药液)，放置4 ℃冰箱，备用。

1.6 慢性心阳虚证模型的建立

采用盐酸普罗帕酮法诱导，对文献[2]方法进行改进，盐酸普罗帕酮剂型由注射剂改为片剂，给药方式由腹腔注射改为灌胃给药，具体操作如下：除正常对照组外，其他组动物每天上午9时灌胃给予盐酸普罗帕酮片，25 μg/g体质量，隔日1次，持续给予8次。每次灌胃前均重新称量体质量，并作为该次用药剂量的计算标准。正常对照组灌胃同体积的纯净水。

1.7 给药方法

大鼠经盐酸普罗帕酮诱导8次后，各给药组按表4给药剂量于每天下午灌胃给予相应的药物，10 μL/g，连续30 d。正常对照组和模型对照组灌胃给予同体积的水。给药期间，除正常对照组外，其余各组继续给予盐酸普罗帕酮灌胃，每隔2日1次。每周称量体质量2次。

1.8 检测指标

各组动物末次给药后50 min，以氨基甲酸乙酯麻醉(1 g/kg)；仰卧固定，打开胸腔，迅速剥离心脏；生理盐水洗净残留血液；剪取相同部位组织0.1 g左右，精细称量质量；加9倍体积预冷生理盐水，放置于预冷的全自动组织研磨仪内，60Hz频率下匀浆90 s，制成质量分数100 g/L的心肌组织匀浆液；4 ℃、4 500 r/min离心10 min；分离上清液，按照试剂盒说明书用紫外可见分光光度计分别于595 nm、550 nm、412 nm和636 nm检测组织蛋白、SOD、GPX、Ca2+-Mg2+ATP酶和Na+-K+ATP酶活力。动物处理前禁食但不禁水14 h。

1.9 统计学方法

2 结 果

桂枝、甘草各配伍组大鼠心肌组织SOD、GPX、Ca2+-Mg2+ATP酶、Na+-K+ATP酶活力值均高于其相对应模型对照组。其中配伍4组的SOD、配伍5组的GPX、配伍3组的Ca2+-Mg2+ATP酶和Na+-K+ATP酶活力与其相对应的模型对照组对比，差别均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠心肌组织SOD、GPX、 ATP酶活力对比

注：与模型对照组对比，*P<0.05。

3 讨 论

配伍是方剂“活的灵魂”，方剂配伍原理探究是方剂研究的核心[3]。辛甘化阳是方剂性味配伍中五味配伍法之一，亦称辛甘助阳或辛甘扶阳[4]。该配伍理论的渊源要追溯到《内经》时代，《素问·至真要大论》在阐述药物性味时指出“辛甘发散为阳”，金代医家成无己在《注解伤寒论》中首先提出辛甘化阳的概念。所谓辛甘化阳，是指由辛味药和甘味药相合，以化生或资助阳气的一种配伍方法[2]。此处的阳气即五脏阴阳精气理论所指的具有温煦、推动、兴奋等作用的气，是人体生命活动的物质基础，是影响人体生命健康的关键，是生命的动力和源泉，正如《素问·生气通天论》所云：“阳气者，若天与日，失其所则折寿而不彰”。现代医学则提出能量是生命的动力[5]。因此，笔者将中医“阳气”与现代医学“能量”联系起来，从能量代谢相关酶层面探讨《伤寒论》桂枝、甘草配伍“辛甘化阳”原理与内涵。

在正常的生理情况下，机体中的抗氧化防御系统与机体产生的活性氧处于一个动态的平衡状态；当机体受到外部有害因素的影响,这种平衡就可能被破坏,表现为活性氧过多或抗氧化剂减少,从而使活性氧堆积产生进行性的脂质过氧化并最终损伤细胞。SOD和GPX均是机体抗氧化防御体系中重要的酶, 具有清除超氧自由基,从而抑制心肌细胞膜损害，提高心肌ATP酶活力，达到间接调节心肌组织能量代谢作用[6]。ATP作为组织细胞能够直接利用的唯一能源,其合成和分解是机体内能量转移和利用的关键环节。ATP的分解是在ATP酶作用下进行的。ATP酶既可影响产能过程,又关系到能量的转移和利用；因此，其活性是反映机体能量代谢水平的一项重要指标。Ca2+-Mg2+ATP酶和Na+-K+ATP酶是心肌内能量代谢的标志酶, 在细胞运动、收缩、代谢调节中起重要作用，其活性的降低则是细胞膜受损的标志之一,与缺氧及氧自由基生成有关[7]。

本实验结果表明：《伤寒论》桂枝、甘草各配伍组均能提高盐酸普罗帕酮所致心阳虚证大鼠心肌组织SOD、GPX、Ca2+-Mg2+ATP酶、Na+-K+ATP酶活力，其中配伍4组的SOD、配伍5组的GPX、配伍3组的Ca2+-Mg2+ATP酶和Na+-K+ATP酶活力与其相对应的模型对照组对比，差别均具有统计学意义(P<0.05)。因此，笔者认为：《伤寒论》桂枝、甘草配伍“辛甘化阳”原理的内涵与干预心阳虚证大鼠心肌组织能量代谢酶有关，其作用的发挥与桂枝、甘草配伍比例及煎煮时间密切相关，当桂枝12 g、甘草21 g、煎煮15 min，桂枝15 g、甘草6 g、煎煮50 min，桂枝9 g、甘草9 g、煎煮25 min时，对SOD、GPX、Ca2+-Mg2+ATP酶、Na+-K+ATP酶活力影响最为明显。

[1]姚凤云，王炳志，丁舸.浅析《伤寒论》之辛甘化阳法[J].时珍国医国药，2010，21(11)：2959-2960.

[2]曾代文，彭成，余成浩，等.附子与干姜组分配伍对急性心衰心阳虚证大鼠血浆肾素-血管紧张素-醛固酮系统的影响[J].中药药理与临床，2011,27(4)：5-7.

[3]李然，张林，李冀.方剂学以“配伍”为核心教学法的探讨[J].辽宁中医药大学学报，2011，13(8)：158-159.

[4]滕佳林，韩涛.辛甘扶阳的配伍意义与方剂举隅[J].南京中医药大学学报，2003,19(5)：270-272.

[5]徐建兴，吕斌.呼吸链作为“生命引擎”的工作原理和中医阴阳五行理论的阴阳元素[J]. 科学中国人，2011，(19)：76-79.

[6]王咏梅. 自由基与谷胱甘肽过氧化物酶[J].解放军药学学报，2005，21(5):369-371.

[7]李丽萍, 刘秀芳, 宁艳花，等. DEHP对大鼠睾丸能量代谢酶的影响及其氧化损伤作用[J]. 宁夏医科大学学报，2010，32(1)：74-77.

(编辑 陶 珠)

1001-6910(2015)01-0059-04

R222

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2015.01.31

王炳志，副教授，wbzh1123@163.com

国家自然基金资助项目(81260524)；江西省自然基金资助项目(20122BAB205072)；江西省卫生厅资助项目(2012Z001)

2014-08-28；

2014-10-30